论文摘要
拟态弧菌（Vibrio mimicus）是一种常见的病原弧菌,不仅可引起鱼蟹类严重的腹水病,而且还可以通过水产动物和水产品感染人类,引起腹泻和食物中毒。目前该病防治的主要方法是使用抗生素,但是随着抗生素的反复使用,细菌耐药性问题和药残所致的水产品安全问题愈来愈突出。为此,本课题以拟态弧菌安徽分离株为研究对象,在探明其耐药性和外毒素致病性的基础上,系统研究了中草药对拟态弧菌的抑菌抗毒素活性,旨在筛选出最佳中草药复方,为后续临床试验研究提供材料,以及为研制治疗腹水病的中草药制剂奠定基础。首先,对拟态弧菌安徽分离株进行外毒素基因PCR检测和外毒素致病性测定。研究中根据拟态弧菌或霍乱弧菌的外毒素基因（vmhA、hlyA、ctxA、zot、ace）序列设计引物,以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增外毒素基因,构建其重组质粒并进行序列测定与分析。结果显示:4株拟态弧菌均携带外毒素基因,但不同分离株的毒素基因型有所不同,分别为vmhA+hlyA-ctxA-zot-ace-（HX4菌株）、vmhA-hlyA+ctxA-zot-ace-（04-13菌株）、vmhA-hlyA+ctxA-zot+ace-（04-14菌株）和vmhA-hlyA-ctxA-zot+ace-（04-5菌株）。HX4菌株vmhA片段长1 391 bp,与拟态弧菌唯一参考株的相应核苷酸同源性达97.3%;04-13和04-14菌株的hlyA片段长934 bp,与国内外参考株的同源性在92.4%～99.3%之间。在应用蛋白分离技术提取拟态弧菌外毒素的基础上,采用血琼脂平板扩散法和微量板法测定其溶血性,采用动物实验法测定其致病性。结果显示4株拟态弧菌外毒素对实验小鼠和草鱼均有极强的肠毒性和致死性。除04-5分离株无溶血性外,其余3株均具有溶血活性,溶血价在1∶64～1∶256之间。表明外毒素在拟态弧菌致病过程中起着重要作用。其次,对拟态弧菌安徽分离株进行耐药性检测。研究中采用K-B纸片琼脂扩散法测定了4株拟态弧菌对19种抗生素的耐药性。结果显示它们对β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素均有不同程度的耐药性,呈现多重耐药性。最后,系统测定中草药对拟态弧菌的抑菌抗毒素活性以及对草鱼肠道内细菌数量和优势菌群种类的影响。研究中采用平板打孔法测定27味中草药的体外抑菌活性,并选取抑菌活性为中敏和中敏以上的中草药,采用改良微量稀释法测定其最低抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）。结果显示黄连、大黄、金银花和秦皮的抑菌活性最好,达到高度敏感,其MIC值在1.96～62.72g/L之间,其次为夏枯草、地锦草、丹皮、连翘和黄柏,达到中度敏感,其MIC值在31.36～250 g/L之间。以上述9味中草药为主药,在主药中加入佐药茯苓和车前子以及使药黄芪和甘草组成5个复方测定其体外抑菌和间接拮抗毒素活性。结果显示复方5的体外抑菌活性最好,对4株拟态弧菌的MIC值均为1.96 g/L;其次是复方1和复方3,其MIC值在1.96～7.84g/L之间;复方2和复方4的抑菌活性较低,其MIC值在31.36～125g/L之间。复方5的间接拮抗毒素活性最强,复方2、复方3和复方4次之,复方1不具有抗毒素活性。综合考虑确定复方5的配伍效果最好,具有较强的体外抑菌和间接抗毒素分泌的作用。进一步采用人工感染试验和细菌学方法分别测定复方5的体内抗菌活性及其对草鱼肠道内细菌数量和优势菌群的影响。结果显示复方5可以保护实验草鱼抵抗拟态弧菌的创伤浸浴感染,减少草鱼肠道内细菌数量和抑制条件致病性气单胞菌和不动杆菌的生长。综上所述,本研究在探明拟态弧菌耐药性及其外毒素致病性的基础上,成功筛选出具有体外抑菌、体内抗菌、间接拮抗毒素和免疫调节活性的中草药复方。研究结果不仅为后续临床试验研究提供了材料,也为研制治疗腹水病的中草药制剂奠定了基础。