论文摘要
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性自身免疫性疾病,早期症状为病患关节红热、肿痛和活动障碍,晚期出现关节僵硬和畸形,并伴有不同程度的骨骼肌萎缩,致残率很高。除病患关节的炎性病变以外,RA还累及心、肺、肾等多种器官,严重时危及生命。类风湿关节炎在全世界成人中的发病率约占1%-2%,总计约有2000万患者,严重威胁着人类健康和生存质量。我国RA的平均发病率接近0.4%,70%的患者2年后致残。因此,探索和阐明RA滑膜增殖的病理生理过程,研究开发有效的治疗方法和药物以期提高类风湿患者的生存率和生存质量意义十分重大。RA的病理表现为炎症反复发作、滑膜组织过度增殖和功能异常、关节软骨和骨质遭受滑膜细胞、血管翳的侵蚀和破坏。近年来磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）信号通路的激活已被认为是细胞抗凋亡并引起异常增殖的重要机制之一。有研究表明该通路在RA中呈过度活化状态,PI3K/Akt信号通路和IL-1, TNF, NF-κB等炎性相关细胞因子联系紧密,可能在RA病理过程中起到重要作用。PTEN和Akt分别是PI3K/Akt信号通路中的负调节因子和效应因子。PTEN是具有蛋白、脂类双特异性的磷酸酶,通过使PIP3去磷酸化抑制PI3K的活化信号向Akt传递,下调PI3K/Akt信号通路活性。PTEN有多种底物,除对PI3K/Akt信号通路的调节外,还广泛地参与抑制细胞运动,调节细胞周期,维持染色体稳定性等。RA中PI3K/Akt信号通路的过度活化可能和PTEN功能降低或者缺失有关。因此,在RA成纤维样滑膜细胞中表达PTEN基因,可以研究PTEN在RA中的功能。类似地通过构建靶向Akt的RNA干扰片段的载体并表达,对Akt进行特异性抑制,可以阻断PI3K/Akt信号通路,研究Akt在RA成纤维样滑膜细胞的抗凋亡、促增殖等调节功能。RNA干扰技术是近年来发现的一种新的诱导基因沉默的技术。当外源性或内源性双链RNA（dsRNA）进入细胞后,能够识别含有其互补序列的mRNA并与之结合,在酶的作用下特异性降解mRNA,从而干扰相应基因表达,导致基因沉默。RNA干扰效应具有高特异性、高稳定性、高效性,已成为研究特定基因功能的重要工具。外源基因或目的基因转移至靶细胞的方法可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒表达系统转移效率低,病毒载体系统具有高效性的特点。常用的病毒载体有慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体,其中慢病毒载体对分裂期和非分裂期细胞都可以感染,并具有较小的免疫反应,成为目前研究最多、最理想的基因转移载体之一。本课题应用慢病毒表达系统构建了两个载体,一个用于增强PTEN表达,另一个以RNA干扰的方式敲减Akt的表达。两个载体分别转染RA FLS并观察病毒载体对相应基因表达的作用效果,及其对细胞增殖、迁移能力的影响,研究PTEN和Akt基因在RA病理过程中的作用机制。第一部分类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的培养及PTEN/Akt的表达目的研究RA FLS的增殖和生长特征以及PTEN、Akt和p-Akt蛋白在RA中的表达情况。方法免疫组化检测RA和OA滑膜组织石蜡标本中PTEN和Akt两种蛋白的表达位置和表达量,采用组织块培养法培养RA FLS和OA FLS,流式细胞仪检测RA FLS纯度,通过MTT法检测OA FLS和RA FLS增殖并绘制生长曲线,Western Blot检测两种细胞中PTEN蛋白和Akt、p-Akt蛋白的表达量。结果1、免疫组化结果显示,PTEN蛋白在OA滑膜组织中的表达高于RA滑膜组织,在RA滑膜细胞中的表达集中于细胞核内；Akt蛋白在OA滑膜组织中的表达低于RA滑膜组织,在RA滑膜细胞中的表达也集中于细胞核内。2、从组织块培养出的RA FLS传4代后,免疫荧光染色的细胞经流式细胞仪检测,纯度可达99%以上,可以进行后续试验。3、MTT检测到第4代RA FLS和OA FLS在传代第3天增殖出现明显差异, RA FLS吸光值为0.31, OA FLS吸光值为0.259（p<0.05）,以后各个检测点均有统计学意义。4、RA FLS中PTEN蛋白表达量低于OA FLS; Akt和p-Akt蛋白的表达量高于OA FLSO结论PTEN蛋白在RA FLS中的表达低于OA FLS, Akt蛋白在RA FLS滑膜组织中的表达高于OA FLS, RA FLS的增殖速度高于OA FLS。第二部分PTEN慢病毒增强表达载体和靶向Akt基因的shRNA慢病毒表达载体的构建目的构建增强PTEN表达的pLenti6/V5-PTEN慢病毒表达载体；筛选有效的Akt siRNA靶序列,构建靶向Akt的RNA干扰慢病毒表达载体。方法1、获得PTEN全长基因,与表达载体质粒pLenti6/V5定向克隆连接,构建成pLenti6/V5-PTEN表达载体,设pLenti6/V5-NC为阴性对照；根据Akt mRNA设计合成两条干扰序列和一条随机序列作对照,克隆到入门载体pENTRTM/U6,鉴定正确后与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST进行LR重组,构建成靶向Akt的shRNA表达载体pLenti6/shAkt-1、pLenti6/shAkt-2,设pLenti6/shAkt-NC为阴性对照,测序正确的表达载体通过脂质体法转染LOVO细胞检测功能。2、将构建成功的表达载体分别与ViraPowerTM Packaging Mix共同转染状态良好、融合度80%-90%左右的293T细胞,细胞继续培养48h、72h后收取含有病毒的上清液,测病毒滴度,冻存待用。结果1、pLenti6/V5-PTEN转染LOVO细胞,检测到PTEN mRNA和蛋白表达的增加；入门载体pU6/shAkt-1、pU6/shAkt-2,表达载体pLenti6/shAkt-1 pLenti6/shAkt-2分别转染LOVO细胞,检测到Akt mRNA和蛋白表达受到抑制,其中pLenti6/shAkt-2的抑制效果显著。2、将重组质粒pLenti6/V5-PTEN.pLenti6/V5-NC.pLenti6／shAkt-1. pLenti6/shAkt-2.pLenti6/sh NC分别在293T细胞中包装成慢病毒表达载体,测得病毒滴度分别为1.5×107TU/ml、8×106TU/ml、4×106TU/ml.4.3×106TU/ml和7.4×106TU/ml。结论成功构建了增强PTEN表达的慢病毒表达载体pLenti6/V5-PTEN和靶向Akt的RNA干扰慢病毒表达载体pLenti6/shAkt-2。第三部分pLenti6/V5-PTEN和pLenti6/shAkt慢病毒表达载体对RA FLS增殖、迁移及蛋白表达的作用目的研究在PTEN和Akt基因对RA FLS中的功能以及对RA FLS增殖、迁移的影响,分析PTEN和Akt蛋白在RA发病机制中的作用。方法1、将稀释后的pLenti6/V5-PTEN、pLenti6/V5-NC、pLenti6/shAkt-1. pLenti6/shAkt-2、pLenti6/sh NC病毒溶液分别转染RA FLS,设未转染病毒的RA FLS为对照组,通过RT-PCR和Western Blot检测PTEN. Akt mRNA和蛋白表达的变化,以及对p-Ak的表达的调节。2、病毒溶液分别转染RA FLS, MTT染色比较增殖情况,划痕实验检测转染病毒后RA FLS迁移能力的变化,设未转染病毒的RA FLS为对照组。结果1、pLenti6/V5-PTEN转染RA FLS后PTEN mRNA表达量显著提高,24h、48h、72h、96h 4个时段RT-PCR结果显示,与对照组相比PTEN mRNA表达量分别增加了76.02%、63.67%、67.24%和72.83%（p<0.05）。转染pLenti6/shAkt-1和pLenti6/shAkt-2后24h、48h、72h、96h4个时段RT-PCR结果显示,pLenti6/shAkt-2组细胞的Akt各亚型表达显著降低,与对照组相比,Aktl分别降低了76.13%、65.1%、79.12%和70.18%（p<0.05）；Akt2和Akt3与对照组相比也有显著差异（p<0.05）.pLenti6/shAkt-1组与对照组相比,Akt各亚型mRNA呈微弱降低,其中Aktl mRNA表达量分别降低14.15%和14.84%（p>0.05）。2. Western Blot结果显示,培养48h后PTEN蛋白的表达量与对照组相比提高107.85%,而p-Akt的含量降低了48%（p<0.05）,pLenti6/shAkt-2组Akt蛋白的表达量与对照组相比降低了76.19%（p<0.05）,p-Akt的含量降低了58.75%（p<0.05）；pLenti6/shAkt-1组无明显变化。3. pLenti6/V5-PTEN转染RA FLS后24h、48h、72h、96h4个时段,检测吸光值分别降低了4.46%、25.14%、41.84%和52.46%,从48h后RA FLS增殖明显低于对照组,增殖差异具有统计学意义（p<0.05）。pLenti6/shAkt-2转染RA FLS后,从第48h开始实验组与对照组相比吸光值出现明显差异,pLenti6/shAkt-2组4个时段RA FLS吸光值分别降低12.81%,27.5%、44.69%和56.80%。4、划痕实验显示转染pLenti6/V5-PTEN和pLenti6/shAkt-2后细胞迁移能力降低,培养72h后发现2组细胞进入划痕区的细胞明显少于各自的对照组,越过划痕边界的距离也小于对照组。结论pLenti6/V5-PTEN和pLenti6/shAkt-2转染RA FLS后能够显著降低p-Akt的表达,并抑制RA FLS的增殖和迁移。
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