pthA-nls及其ScFv基因转化柑橘获得抗溃疡病新种质的研究

论文摘要

柑橘溃疡病（citrus bacterial canker disease）是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv.citri）引起的一种世界性检疫性病害,对柑橘产量及品质影响极大,严重危害着柑橘产业的健康发展。然而,到目前为止,尚无一种能根除柑橘溃疡病菌的最佳方法,柑橘品种资源中亦未发现完全抗病的品种,长期的常规育种,也没有获得抗柑橘溃疡病的优良杂种,柑橘抗溃疡病育种没有取得实质性进展。病原基因pthA是柑橘溃疡病亚洲型（A型）致病所必需的因子,其中3个核定位信号区是PthA的重要功能区,在寄主细胞内起识别定位的作用。本研究以柑橘溃疡病致病基因pthA为出发点,利用病原基因诱导植物获得抗性原理,将致病基因pthA的核定位信号NLSs构建正义和反义基因,导入柑橘感病品种甜橙中,使其过量表达失去原有功能的蛋白,或表达蛋白失去原有的时空性,或表达蛋白激活植物本身的防御系统,从而干扰病原菌的正常的生理代谢;另一方面,利用单克隆抗体和植物抗体技术,制备抗致病因子PthA核定位信号肽NLS单克隆抗体,分离出抗体基因的轻链和重链,并构建单链抗体基因ScFv,将其导入柑橘感病品种,通过在柑橘体内表达抗体蛋白,结合致病因子PthA蛋白的功能位点,阻断致病蛋白向细胞核的运输途径,从而达到抗病的目的。通过对转基因甜橙的抗性筛选和外源基因的表达分析,对进一步研究柑橘溃疡病的致病机理具有重要的理论意义。同时,选择高感病的主栽品种甜橙进行试验,获得的抗病新种质,从根本上控制柑橘溃疡病的危害,对柑橘产业意义重大。本研究取得研究结果如下:1、从湖南省各柑橘产区感病果园分离纯化柑橘溃疡病菌株50份,并根据致病基因pthA和柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因差异序列,设计筛选出特异性引物对,通过优化PCR反应条件,利用PCR技术从质粒和基因组两方面对柑橘溃疡病进行鉴定,并利用离体接种对获得的菌样作最终鉴定,为后续试验提供了试验材料。2、利用long-PCR和net-PCR方法,得到pthA完整的编码区并将其克隆到植物表达载体pBI121中。序列分析结果表明,克隆得到的pthA′与Genbank中的pthA（U28802）序列有99.8%的同源性。pthA′基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。3、构建了pthA-nls正义基因和pthA-a-nls反义基因植物表达载体,利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗,经PCR检测,成功获得了9株转pthA-nls和12株转pthA-a-nls基因甜橙转基因苗,目前转基因苗长势良好。对9株转pthA-nls基因甜橙中的生长势好的3株进行Southern杂交分析,证明pthA-nls基因已成功整合到甜橙基因组中,通过RT-PCR对这3株转基因植株进行表达分析,检测到了外源目的基因的表达。以溃疡病菌液接种转pthA-nls基因和pthA-a-nls及对照甜橙植株离体叶片,接种试验结果表明,转pthA-nls基因植株叶片对溃疡病表现出一定的抗性,而转pthA-a-nls基因植株叶片对溃疡病表现与对照一样敏感。4、采用PCR法扩增出pthA基因末端NLSs序列,并将其克隆到原核表达载体PET32a（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ位点。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达重组蛋白,经Ni2+-NTA纯化柱纯化得到纯化的重组蛋白,免疫Balb/c小白鼠,制备了相应的抗血清。Western blotting、ELISA鉴定结果表明,获得的抗血清可特异地结合重组蛋白亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片,发现抗血清对溃疡病的发生具有一定的拮抗作用,能推迟溃疡病菌的致病过程,且病斑比对照小,但未能达到抗病的程度。5、制备了抗PthA-NLS重组多肽的3株单克隆抗体（McAb）,McAb能够特异性、高亲和力地与PthA-NLS多肽结合。这3株McAb可被进一步用于柑橘溃疡病的鉴定检测,并为下一步制备单链抗体的研究提供杂交瘤细胞株。6、通过RT-PCR成功地扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因,采用重叠延伸PCR将两个可变区基因串联,获得的单链抗体基因大小约750 bp,将其克隆到T载体和原核表达载体pET32a（+）,通过酶切和PCR鉴定均获得了约750 bp大小的条带。测序结果显示,重链可变区基因有360 bp,轻链可变区基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 KD的ScFv重组蛋白。7、将ScFv基因构建到植物表达载体pBI121中,利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗,经PCR检测,成功获得了12株转ScFv基因甜橙,利用RT-PCR分析外源基因ScFv在转基因植株中的表达,初步表明外源基因ScFv已成功转入到甜橙基因组中,并能在甜橙体内正常表达。采用离体接种对部分转ScFv基因植株进行抗性筛选,结果表明,转基因植株对溃疡病表现出一定的抗性,株系之间抗性存在着差异,其中D9可能是很有希望的抗性材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 柑橘抗溃疡病育种研究现状
• 1.1 柑橘溃疡病发生历史及病害分布
• 1.2 病菌特性及发病症状
• 1.3 柑橘溃疡病病菌分类鉴定研究
• 1.4 柑橘溃疡病病菌基因组研究
• 1.5 柑橘溃疡病病菌致病机理研究
• 1.5.1 柑橘溃疡病病菌pthA基因
• 1.5.2 柑橘溃疡病病菌pthA与宿主相互作用的可能机理
• 2 植物抗细菌性病害研究进展
• 2.1 病原菌致病相关基因
• 2.1.1 毒性基因
• 2.1.2 无毒基因
• 2.1.3 决定寄主范围的基因
• 2.2 植物抗细菌病害基因工程的研究
• 2.2.1 阻断病原细菌的致病途径
• 2.2.2 降解病原菌致病毒素
• 2.2.3 导入抗病基因
• 2.2.4 单克隆抗体的应用潜力
• 2.2.5 病原菌无毒基因的利用
• 2.2.6 增强激发子的产生
• 2.2.7 利用RNAi干扰
• 3 植物抗体工程研究进展
• 3.1 抗体基因的结构及特征
• 3.2 基因工程抗体的研究进展
• 3.2.1 嵌合抗体
• 3.2.2 重构抗体
• 3.2.3 单链抗体
• 3.2.4 抗体基因组文库
• 3.3 植物抗体及其应用
• 3.3.1 提高植物抗病虫性
• 3.3.2 调控植物代谢
• 4 开展本研究的目的与意义
• 5 技术路线
• 第二章 柑橘溃疡病菌的分离和检测
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 样品准备
• 1.2.3 针刺接种试验
• 1.2.4 PCR检测
• 1.2.5 JYF5/JYR5 PCR产物克隆测序
• 2 结果与分析
• 2.1 菌种分离
• 2.2 针刺离体接种鉴定
• 2.3 PCR检测结果
• 2.4 JYF5/JYR5扩增产物克隆测序结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 致病基因pthA的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 溃疡病病菌质粒提取
• 1.2.3 pthA基因5′和3′端序列PCR扩增
• 1.2.4 pthA基因5′和3′端PCR扩增产物的回收纯化
• 1.2.5 pthA基因5′和3′端PCR扩增产物克隆
• 1.2.6 pthA基因全长PCR扩增
• 1.2.7 pthA基因long-PCR扩增产物的回收纯化
• 1.2.8 pthA巢式PCR（net-PCR）扩增
• 1.2.9 pthA基因巢式PCR扩增产物回收片段双酶切
• 1.2.10 植物表达载体pBI121质粒提取及双酶切
• 1.2.11 pthA基因与载体连接转化
• 1.2.12 菌落PCR扩增鉴定与摇菌培养
• 1.2.13 生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 pthA基因5′和3′端序列克隆
• 2.2 pthA基因5′和3′端序列分析
• 2.3 pthA基因全长的克隆
• 2.4 pthA′序列分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 pthA-nls正反义基因构建及对甜橙遗传转化的研究
• 第一节 正义基因pthA-nls植物表达载体构建及对甜橙遗传转化的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要培养基配方
• 1.3 pthA-nls正义基因植物表达载体构建
• 1.3.1 核定位信号（NLSs）序列的扩增、克隆和测序
• 1.3.2 pthA-nls质粒转化农杆菌
• 1.4 pthA-nls对甜橙的遗传转化
• 1.4.1 受体材料的获得
• 1.4.2 对照材料芽的诱导
• 1.4.3 外植体转化处理
• 1.4.4 抗性芽的诱导
• 1.4.5 不定芽微芽嫁接成苗
• 1.4.6 温室二次嫁接
• 1.5 转pthA-nls甜橙PCR鉴定
• 1.5.1 基因组DNA的提取
• 1.5.2 转化再生植株的PCR检测
• 1.6 转pthA-nls基因甜橙外源基因RT-PCR表达分析
• 1.6.1 RNA的提取
• 1.6.2 RT-PCR反应
• 1.7 转pthA-nls甜橙外源基因southern杂交分析
• 1.7.1 总DNA提取
• 1.7.2 探针的制备
• 1.7.3 总DNA的限制酶消化
• 1.7.4 总DNA电泳
• 1.7.5 转膜
• 1.7.6 紫外交联
• 1.7.7 预杂交和杂交
• 1.7.8 洗膜
• 1.7.9 显影
• 1.8 转基因植株抗性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 pthA-nls的克隆
• 2.2 pthA-nls基因植物表达载体的构建
• 2.3 pthA-nls对甜橙的遗传转化结果
• 2.4 转pthA-nls基因甜橙外源基因表达分析
• 2.4.1 总RNA提取
• 2.4.2 外源基因pthA-nls表达分析
• 2.5 转pthA-nls甜橙外源基因southern杂交分析
• 2.6 转pthA-nls植株抗性试验
• 3 讨论
• 第二节 反义基因pthA-a-nls植物表达载体构建及对甜橙遗传转化的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 核定位信号（NLS）序列的扩增、克隆和测序
• 1.3 反义基因pthA-a-nls对甜橙的遗传转化和鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 反义基因pthA-a-nls的构建
• 2.2 pthA-a-nls对甜橙的遗传转化结果
• 2.3 转pthA-a-nls植株抗性试验
• 3 小结
• 第五章 PthA-NLS抗血清制备及其对柑橘溃疡病的抑制作用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 核定位信号（NLSs）序列的扩增、克隆和测序
• 1.3 重组多肽的诱导表达
• 1.4 重组多肽的纯化
• 1.5 鼠抗PthA-NLS血清的制备
• 1.6 抗血清的效价测定
• 1.6.1 间接ELISA法检测
• 1.6.2 抗血清特异性Western Blotting检测
• 1.7 抗血清对病原菌生长和柑橘溃疡病发病的抑制作用的测试
• 2 结果与分析
• 2.1 致病基因pthA核定位信号序列NLSs的PCR扩增
• 2.2 NLSs序列的克隆与测序
• 2.3 重组PthA-NLS多肽的原核表达及其纯化
• 2.4 鼠抗PthA-NLS血清的制备与特异性鉴定
• 2.5 抗血清对柑橘溃疡病病菌生长和病害发生的抑制效果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及ScFv基因构建
• 第一节 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 技术路线
• 1.3 方法
• 1.3.1 脾细胞准备
• 1.3.2 融合过程
• 1.3.3 有限稀释法建立克隆株
• 1.3.4 杂交瘤细胞的大量繁殖
• 1.3.5 单克隆抗体的鉴定
• 1.3.6 单克隆抗体的类和亚类鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 分泌抗PthA-NLS单克隆抗体阳性杂交瘤细胞的获得
• 2.2 Western Blotting鉴定单克隆抗体
• 2.3 单克隆抗体的类和亚类鉴定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 抗PthA-NLS单克隆抗体ScFv基因的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.1 细胞总RNA提取
• 1.2.2 抗体可变区基因的扩增
• 1.2.3 ScFv基因的构建
• 1.2.4 ScFv的克隆及原核表达
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第七章 单链抗体基因ScFv对甜橙的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 ScFv植物表达载体构建
• 1.2.3 ScFv基因转化甜橙
• 1.2.4 转ScFv基因甜橙PCR分子鉴定
• 1.2.5 转ScFv基因甜橙RT-PCR表达分析
• 1.2.6 转ScFv基因甜橙离体接种抗性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 ScFv基因植物表达载体构建
• 2.2 ScFv对甜橙的遗传转化结果
• 2.3 转ScFv基因甜橙ScFv基因表达分析
• 2.4 转ScFv基因甜橙离体接种抗性试验
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 论文创新点
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历