缺血再灌注器官型脑片神经再生的作用及机理研究

论文摘要

脑血管病是严重危害人类健康的一类常见病。在我国,脑血管病的危害尤为严重。在一项有12个国家20多个中心参加、总监测人年数（35～64岁）超过1500万的“多国心血管病趋势和决定因素监测”（MONICA）研究中,17个中心监测结果显示:脑卒中总死亡率前苏联最高;男性死亡率,我国排第5:女性死亡率,我国的北京位居第2。据卫生部统计中心来自全国各省市数千万人的疾病监测资料显示:我国1988～2001年脑血管病死亡率在105/10万～135/10万之间。脑血管病以高发病率、高患病率、高死亡率以及高致残率的特点受到广泛关注,我国也十分重视脑血管病的防治工作,在“六五”至“九五”计划期间,脑血管病的防治都被列为重点研究项目。在本研究中,着重于通过动物实验、细胞培养及器官型脑片培养技术,探讨缺血再灌注损伤对鼠脑神经再生的作用及机理,为缺血再灌注损伤的干细胞治疗寻求解决途径。所谓缺血再灌注脑损伤是指脑缺血一定时间后再恢复血液灌注,组织损伤反而进行性加重,它是缺血和再灌注两种损伤共同作用的结果。导致脑缺血和缺血再灌注损伤神经元坏死的机制包括:（1）兴奋性氨基酸毒性;（2）线粒体损伤;（3）细胞凋亡;（4）炎症;（5）细胞内钙超载。大多数缺血性脑血管病有明确的病因和促发因素,除了发病初期以救命、挽救缺血半暗带治疗为主外,治疗原则上应根据不同病因与发病机制,采用针对性治疗。目前用以治疗脑缺血的药物和方法多种多样,主要包括:（1）抗凝治疗:（2）溶栓治疗:（3）扩容治疗;（4）扩血管治疗;（5）钙离子拮抗治疗;（6）抗血小板治疗;（7）中药治疗。此外还有防治脑水肿、神经营养、内科基础疾病治疗、外科手术治疗、康复理疗等。因为具有自我更新、多分化潜能、低免疫原性、易与宿主细胞建立正常的细胞联系等特点,神经干细胞（NSCs）成为新兴的、前景光明的治疗方法。探讨如何使用NSCs治疗神经系统的损伤和变性疾病,以及当前的治疗对NSCs如何产生影响成了当前神经科学的研究热点。NSCs主要存在于胚胎神经系统内,在成年脑内的NSCs主要局限于2个神经生发区,室下区（SVZ）和海马齿状回（HDG）。虽然NSCs理论上可以无限增殖并分化为神经系统内所有类型的神经细胞,但是如何利用NSCs修复受损的神经功能仍未达到临床实用阶段。各国学者在这方面进行了大量的研究。目前可将研究大体分为两种策略:（1）外源性NSCs治疗策略。又可细分为:①先移植后分化,即直接将培养、扩增并达到一定密度的NSCs移植入受损脑区或其他部位（如其他脑区、脑室、蛛网膜下腔等）,通过内在的信号引导使NSCs分化为所需的神经细胞以达到治疗目的。②先分化后移植,即通过分化调控将在体外培养的NSCs分化为所需的神经细胞再移植入受损脑区或其他部位,以修复神经系统损伤或退行性疾病。③作为载体,即利用NSCs作为基因治疗的载体,通过转基因技术将编码神经营养因子的基因片段导入待移植的NSCs中,筛选后移植入受损脑区或其他部位,改善局部微环境以利细胞生存、增殖、分化。（2）内源性NSCs治疗策略。通过激活大脑处于G0期的内源性NSCs,使其重新进入细胞循环,增殖、分化,产生各种神经细胞以替代因损伤、变性丧失的细胞,并重新建立神经网络,恢复神经系统功能。因为NSCs移植治疗最终发挥作用的不是NSCs本身,而是由NSCs分化出的各种功能性神经细胞,所以如何调控NSCs增殖、分化是当前神经科学研究热点中的热点。众多研究表明,NSCs的调控是一个复杂的过程,但主要是由外源性因素（细胞因子）和内源性因素（基因）协同作用完成。（1）外源性因素。即调控NSCs增殖、分化的细胞因子。①表皮生长因子（EGF）。EGF是一种诱导NSCs增殖的常用的有丝分裂原,它的作用可能是使那些处于相对静息的干细胞产生对称性分裂,从而增加干细胞数。EGF主要作用于发育较晚期,促进NSCs、神经前体细胞增殖和分化,并且需要胰岛素样生长因子-1（IGF-1）共同参与。②碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。bFGF具有很强的促进NSCs增殖的作用,可激活CNS多个区域的神经前体细胞的潜在再生能力。效应呈浓度依赖性,低浓度（0.1μg/L）时,促进NSCs分裂、增殖,形成神经元克隆;高浓度（1～10μg/L）时,NSCs倾向于生成神经胶质细胞克隆。③促红细胞生成素（EPO）。EPO具有促神经生长、神经营养和神经保护作用。④血管内皮细胞生长因子（VEGF）。VEGF既能刺激神经再生又能刺激血管发生。但在缺血再灌注早期,VEGF更有利于神经再生而不是血管新生。⑤胰岛素样生长因子-1（IGF-1）。IGF-1对神经系统的作用复杂多样,对神经细胞分裂,发育,成熟均有明显的作用。⑥神经细胞黏附分子（NCAM）。NCAM参与了细胞黏附、神经纤维束形成、促进突触的可塑性以及神经元的出芽生长等过程,是神经发育中不可缺少的分子,是NSCs可塑性的重要调节因子。（2）内源性因素。即调控NSCs增殖、分化的基因。①bHLH转录调控因子家族;②BMP家族;③Notch信号系统;④Wnt家族、Pax家族;⑤PTEN基因;⑥REST/NRSF基因;⑦Insc基因。研究表明,中药对NSCs增殖分化也具有促进作用,这可能是中药促进缺血再灌注脑损伤后脑功能重建和再生的机制之一。通心络是基于中医“络病”理论研制的一类新药,近年来应用于缺血性脑血管病的治疗,取得了肯定的疗效,且在前期实验中证实对NSCs增殖分化具有促进作用。本实验利用通心络含药血清作为阳性对照研究缺血再灌注损伤对神经再生的作用及机理。器官型脑片培养技术是近年来发展起来的一种神经组织培养方法。通过将切成一定厚度的脑组织片放置于微孔膜上,再将微孔膜置于培养液上,达到使脑组织片处于气液交界面上,充分得到氧气和营养成分的目的。这个技术的优势在于:较细胞培养来说能更好的模拟体内状态,而较动物实验来说则更有利于控制实验条件、实现实时观察。本实验的主要研究目的是探讨缺血再灌注损伤对神经再生的作用及机理,将采用的主要方法有动物模型制作、NSCs培养和器官型脑片培养,从不同的角度探讨缺血再灌注损伤对神经再生、NSCs增殖、NSCs分化调控等的作用及机制。基于以上考虑及对文献的复习,拟设定本研究的目的如下:（1）进行胚胎鼠脑神经生发区的可视化定位,依据这一研究定向分离培养胚胎NSCs;（2）改良线栓法缺血再灌注损伤大鼠模型,为研究缺血再灌注损伤对神经再生的作用和机理提供可靠的动物模型;（3）观察及探讨缺血再灌注损伤对缺血再灌注损伤动物模型神经再生的作用及相关细胞因子的影响;（4）建立器官型脑片培养技术及缺血再灌注器官型脑片造模方法;（5）观察缺血再灌注损伤对器官型脑片神经再生的作用及相关细胞因子的影响;（6）探讨缺血再灌注损伤对器官型脑片神经再生的影响并比较与胚胎鼠脑神经生发区的异同,以明确在缺血再灌注损伤后NSCs的激活、增殖、迁移、分化等过程。取17d胚胎大鼠脑矢状位切片,每隔30μm取1片切片进行抗Nestin免疫组化染色,在4×目镜下成像,导入电脑进行平面图像重建,获得抗Nestin（+）细胞空间定位。根据NSCs空间定位,从14-17d SD胎鼠颅内取出脑组织,剪碎吹打分离,过滤离心重悬,调整细胞密度为3×105/ml,接种培养瓶后置于CO2培养箱中培养、鉴定、传代。通过改良线栓法制作缺血再灌注损伤动物模型,在术后2h进行评分,将造模成功（评分≥2分）大鼠用于后续实验。分别在超早期（2h）、急性期（3d）和慢性期（7d）取相应模型大鼠和假手术组大鼠脑切片,行抗Nestin免疫组化染色,观察不同时间点NSCs的变化。将大鼠随机分为3d、5d、7d组,制作缺血再灌注损伤动物模型。在相应时间点,取出造模成功大鼠的脑组织,通过RT-PCR法分别检测缺血再灌注损伤侧脑组织和对侧脑组织4种细胞因子（EPO、VEGF、EGF和IGF-1）的mRNA量,观察缺血再灌注损伤对NSCs增殖分化相关细胞因子的影响。取生后3天SD大鼠脑,将包含海马的脑组织冠状位横断,用振动切片机切成厚约300μm脑片,置于Millicell-CM插件微孔膜上,再将插件置于预留1ml脑片培养液的6孔培养板中。置于CO2培养箱中培养。取生长状态良好的脑片制作缺血再灌注脑片。以生理盐水替代脑片培养液,置于充满N2的环境下37℃孵育1h,再以脑片培养液替换生理盐水,放回常规条件下CO2培养箱中培养,模拟缺血再灌注损伤。设立缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组、阳性对照组和阴性对照组。置于CO2培养箱中培养。每天观察器官型脑片的变化,有新生细胞时,在SVZ区随机选取5个等大区域,计数各组新生细胞数。在指定时间取出相应脑片按常规方法进行三重免疫荧光染色。染色前添加BrdU共孵育24h。用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析。在指定时间收集标本进行相关细胞因子检测。分别于不同分组、不同干预、不同时间下,通过酶联免疫吸附试验检测EPO、VEGF的变化,定量PCR法检测EGF、bFGF、IGF-1和NCAM的变化。用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析。结果表明:抗Nestin（+）细胞广泛分布于胚胎神经系统,以嗅球,吻向迁移流（RMS）,室下区,海马,桥脑,小脑,脊髓,部分神经核团等部位最多。可以分离培养出胚胎NSCs。原代NSCs培养通过分裂增殖和相互聚合的方式形成神经球,其中相互聚合是培养初期形成神经球的主要方式。线栓法缺血再灌注动物模型造模成功。病理学表现,缺血再灌注损伤超早期仅见血管红细胞淤滞,急性期可见软化灶形成,慢性期软化灶内细胞溶解、气球样变。超早期无抗Nestin（+）细胞,急性期出现抗Nestin（+）细胞,主要分布于软化灶周边,慢性期未发现抗Nestin（+）细胞。假手术组各期组织结构完整,未发现抗Nestin（+）细胞。EPO、VEGF、EGF和IGF-1在缺血再灌注损伤3d时即已出现增高,前3种细胞因子在第5d时表达量最高,随后逐步下降,而IGF-1表达量逐步增高。器官型脑片培养大体观察,空气面湿润有光泽,周边与微孔膜接合紧密,色泽均一,随着培养时间的延长厚度逐渐变薄,最终维持于相对恒定的厚度继续生长。镜下观察,组织透光均匀,能明显区分出海马、齿状回、脑室等结构。培养3天开始在HDG、SVZ等区域出现新生细胞。细胞多呈相对均一的圆形或椭圆形。经缺血再灌注处理的器官型脑片损伤后即见脑片上新生细胞增多,主要集中在SVZ、HDG等区域。此新生细胞与阳性对照组出现的新生细胞相比形态不规则,个体大小不均一,分布不均匀。缺血再灌注损伤和通心络含药血清均可促进新生细胞数量显著增多,主要分布在SVZ、HDZ区,呈DAPI（+）BrdU（+）Nestin（+）。随着培养时间延长,新生细胞向皮层迁移。在SVZ区随机选取5个等大区域,计数各组新生细胞数,各组间单位区域新生细胞数均存在显著性差异。阳性对照组和缺血再灌注治疗组与缺血再灌注组相比,SVZ、HDG等部位单位区域新生细胞数更多,有显著性差异。在存活脑片培养的全过程中均可观察到似毛细血管血流一样的“微血流”现象。缺血再灌注损伤第1d、3d时EPO OD值各组之间差异具有显著性意义。第1d时按阳性对照组、缺血再灌注治疗组、缺血再灌注组、阴性对照组顺序递减。第3d时按阴性对照组、阳性对照组、缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组顺序递减。第7d时各组之间差异没有显著性意义,OD值递减顺序同第3d。各处理因素交互效应显著。缺血再灌注损伤后各时间点VEGF OD值各组之间差异具有显著性意义。缺血再灌注组和缺血再灌注治疗组VEGF表达逐步升高,阴性对照组迅速下降,而阳性对照组在第3d时表达达最高值。缺血再灌注损伤后EGF的表达,缺血再灌注组、阳性对照组、阴性对照组均在第1d时达峰,后逐步下降,而缺血再灌注治疗组逐步增高。缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组和阳性对照组初期bFGF表达量均较高,7d时缺血再灌注治疗组和阳性对照组表达量均下降,阴性对照组初期bFGF表达量不高,但随着培养时间的延长,bFGF的表达量逐步增高。缺血再灌注损伤抑制了IGF-1的表达,从第3d开始IGF-1表达量出现增高,而缺血再灌注治疗组IGF-1表达量维持稳定。缺血再灌注组、阳性对照组NCAM的表达均增高。缺血再灌注治疗组初期NCAM表达量不高,但随着培养时间延长表达量继续增高。全文小结:（1）进行了胚胎鼠脑神经生发区可视化定位研究,发现胚胎鼠脑内神经生发区分布广泛,推测成年鼠脑的神经生发区不应只有HDG、SVZ等区域,其他多个脑区也应具有神经生发潜能。为神经系统损伤的功能修复研究奠定基础。（2）发现胚胎鼠脑NSCs的时空表达特性:分布广泛、表达充分、都不在G0期。（3）发现胚胎鼠桥脑NSCs分布新区。（4）用数量分析法发现胚胎NSCs培养初期形成神经球的主要方式是细胞之间、细胞团之间以及细胞和细胞团之间的相互聚合。（5）通过胚胎NSCs分离培养证实胚胎鼠脑内存在大量NSCs。（6）发现鼠脑缺血耐受时间长于人类,功能代偿时间早于人类、代偿效果优于人类。（7）证实缺血再灌注损伤后内源性NSCs出现具有时间窗,提出内源性NSCs治疗应在“治疗时窗”内进行。（8）发现内源性NSCs在缺血再灌注损伤中的作用趋势是形成囊状结构包绕坏死区使其局限化。（9）发现缺血再灌注损伤中,内源性NSCs均是原位激活,激活的NSCs主要位于脑损伤周边区域。（10）证实缺血再灌注损伤是促进内源性NSCs发生和增殖的重要因素。（11）证实缺血再灌注损伤促进NSCs增殖分化相关细胞因子EPO、VEGF、EGF以及IGF-1参与神经功能的修复重建及神经生发区的激活。（12）发现缺血再灌注损伤促使器官型脑片神经再生的作用短暂,损伤了后续神经再生的能力。（13）发现器官型脑片SVZ、HDG出现的新生细胞具有放射状向外迁移的趋势。（14）描绘了缺血再灌注器官型脑片神经生发区的新生细胞迁移趋势二维模拟图。（15）发现用器官型脑片能观察在体实验难以观察到的神经生发区NSCs激活、迁移,是研究神经再生的优良体外模型。（16）发现缺血再灌注损伤促进EPO表达,影响EPO表达水平,与对NSCs的影响一致。（17）发现缺血再灌注损伤延迟VEGF表达,与神经系统损伤后慢性期神经系统功能修复有关。（18）发现缺血再灌注损伤与多种因素共同作用促使EGF维持表达。（19）发现缺血再灌注损伤通过持续促进bFGF的表达激活神经再生。（20）发现缺血再灌注损伤抑制了IGF-1表达,从第3d开始IGF-1表达会出现一过性撤退性反应性增高。（21）发现缺血再灌注损伤促进NCAM表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 缺血再灌注脑损伤的发病机理及治疗现状
• 2 神经干细胞研究进展及应用神经干细胞治疗神经系统疾病的可行性和策略
• 3 神经干细胞分化调控研究进展
• 4 通心络治疗脑梗死的进展及可能机理
• 5 器官型脑片研究进展
• 6 我们的思路和研究目的
• 第一章 胚胎鼠脑神经生发区及胚胎神经干细胞可视化定位
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 附图
• 第二章 缺血再灌注损伤对成年鼠脑神经再生的作用及机理研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 2.5 附图
• 第三章 缺血再灌注损伤对器官型脑片神经再生的作用及机理研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 3.5 附图
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 缩略语
• 致谢