抵抗素样分子β参与2型糖尿病肾病早期发生机制及临床价值研究

论文摘要

第一部分抗体芯片技术筛查早期糖尿病肾病相关细胞因子[目的]应用高通量抗体芯片技术开展早期糖尿病肾病相关细胞因子的筛查工作,获得一种或几种早期糖尿病肾病相关的血清学标记物。防法]将早期2型糖尿病肾病患者作为研究对象,以经性别和年龄匹配的2型糖尿病无肾脏并发症患者及正常人作为对照,利用高通量,标记有已知蛋白质的RayBiotech-507细胞因子抗体芯片,检测早期糖尿病肾病患者混合血清中差异表达的蛋白质。[结果]应用细胞因子抗体芯片对早期糖尿病肾病患者、糖尿病无肾脏并发症患者及正常人对照组的混合血清样本分别进行检测,观察到若干差异表达的蛋白质。其中一组34个蛋白质,包括抵抗素样分子β （resistin-like molecule β, RELMβ）, CXCR3, D6, Fas/TNFRSF6和FGF-12等仅在早期糖尿病肾病患者混合血清中可以检测出,而在糖尿病无肾脏并发症患者及正常人血清中未检测到明显表达；一组6个蛋白质细胞因子,包括RANK、AgRP、BCMA、TIMP-3、CCR4和smad-4在早期糖尿病肾病患者混合血清中表达高于糖尿病无肾脏并发症患者2倍以上,而在糖尿病无肾脏并发症患者混合血清中表达亦高于正常人对照组2倍以上；一组10个蛋白质,包括TGF-β1, IL-18BPa, HCC-4/CCL16, TIMP-1, TREM-1, NCAM-1/CD56, Smad1, CRIM1, Glypican3和IL-24在早期糖尿病肾病患者混合血清中表达高于糖尿病无肾脏并发症患者及正常人2倍以上,而在糖尿病无肾脏并发症患者血清中表达与正常人无明显差别；另一组18个蛋白质,如M-CSFR,IL-1R9和TNF-α等仅在早期糖尿病肾病患者和糖尿病无肾脏并发症患者血清中可以检测出,且在早期糖尿病肾病患者混合血清中的表达高于糖尿病无肾脏并发症患者2倍以上。[结论]高通量细胞因子抗体芯片检测显示,早期糖尿病肾病患者、糖尿病无肾脏并发症患者及正常人对照组血清存在若干差异表达的蛋白质。其中,仅在早期糖尿病肾病患者表达的细胞因子,或者在早期糖尿病肾病患者表达明显高于糖尿病无肾脏并发症患者和正常人对照的血清细胞因子,可能参与糖尿病肾病的早期发病过程。第二部分血浆抵抗素样分子β与2型糖尿病微量白蛋白尿的关系[目的]验证细胞因子抗体芯片检测结果,明确RELMβ在2型糖尿病蛋白尿患者的表达情况及影响因素。[方法]采用横断面的病例-对照研究,共纳入1001名30-80岁受试者。其中654名非糖尿病无白蛋白尿者,123名非糖尿病有白蛋白尿患者,152名2型糖尿病无白蛋白尿患者,59名2型糖尿病微量白蛋白尿患者及13名2型糖尿病大量白蛋白尿患者。ELISA法检测受试者血浆中RELMβ的表达含量,同时测定受试者血压、血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、血脂、血肌酐、尿酸、尿白蛋白、尿肌酐等。数据间相关分析采用Pearson相关或Spearman等级相关分析。危险因素及风险评估采用多元直线回归分析和逐步两分类Logistic回归分析。[结果]糖尿病微量白蛋白尿患者血浆中RELMβ的表达含量（201.68+27.77pg/ml）较糖尿病无白蛋白尿患者（153.56±27.77pg/ml）、非糖尿病无白蛋白尿者（142.90±4.12pg/ml）及非糖尿病有白蛋白尿患者（141.41±8.85pg/ml）明显增高（P<0.05）,而在糖尿病无白蛋白尿患者、非糖尿病无白蛋白尿者及非糖尿病有白蛋白尿患者之间无明显差异（P>0.05）。随机271例受试者空腹血浆RELMβ表达水平（150.92±1.49p∥ml）与口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）2h血浆RELMβ表达水平（151.89±1.50pg/ml）没有明显差异（P>0.05）,并且两者高度相关（r=0.95,P<0.05）。在不同的病例-对照组内,不同性别以及年龄段之间血浆RELMβ水平没有明显差别（P>0.05）。血浆RELMβ水平与腰围、腰臀比、腰身比、OGTT2h血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、尿肌酐、肾小球滤过率、尿白蛋白肌酐比、尿酸和白介素1受体拮抗剂具有显著相关性（P<0.05）。糖化血红蛋白、臀围、体脂含量、肾小球滤过率和收缩压是血浆RELMβ水平的独立影响因素。将血浆RELMβ水平进行四分位,第四分位的患者出现糖尿病微量白蛋白尿的风险是第一分位患者的2.155（95%CI1.214-3.825）倍。进一步校正年龄、性别、体重指数、血压、血糖和血脂之后,该风险仍然存在。血浆RELMp水平可作为诊断糖尿病微量白蛋白尿的备选生物标记物,诊断效能为0.631,敏感性和特异性分别为55.2%和65.1%。在老年女性人群中,其诊断效能达到0.719,敏感性和特异性分别为70.6%和68.8%。[结论]血浆RELMβ水平在糖尿病微量白蛋白尿患者中表达增加。不同性别和年龄段对血浆RELMβ水平没有明显影响。高血浆RELMp水平患者发生糖尿病微量白蛋白尿的风险增加。RELMβ可能成为糖尿病肾病早期诊断的生物学标记物。第三部分抵抗素样分子p的肾脏表达定位及生物学功能[目的]明确RELMβ在肾脏组织的表达定位,初步探讨高糖刺激下人肾小球系膜细胞RELMβ表达变化以及RELMβ蛋白对于人肾小球系膜细胞生物学功能的影响。防法]选取正常SD大鼠作为对照,STZ腹腔注射构建糖尿病及糖尿病肾病大鼠模型。运用免疫组化及细胞免疫荧光技术检测肾脏组织及细胞的RELMβ表达情况。高糖、高脂、高糖联合高脂干预人肾小球系膜细胞,分别使用western blotting和ELISA法检测细胞内及细胞上清液中RELMβ蛋白的表达情况。予不同浓度外源性RELMP蛋白干预人肾小球系膜细胞,MTT法检测系膜细胞的增殖情况。[结果]糖尿病肾病组SD大鼠尿白蛋白排泄率及肾重较糖尿病组及正常对照组SD大鼠显著增加,糖尿病肾病组及糖尿病组SD大鼠血糖较正常SD大鼠显著增加,体重显著下降（P<0.05）。糖尿病肾病组SD大鼠肾脏病理及免疫组化提示系膜明显增厚,RELMβ主要集中在糖尿病肾病SD大鼠的肾小球系膜区,肾脏组织其他区域未见明显表达。在糖尿病肾病大鼠肾小球结构中RELMβ蛋白的表达量（3级）较糖尿病无肾脏并发症大鼠（0级）及正常SD对照大鼠（0级）明显增加。选取人肾小球系膜细胞行免疫荧光检测,观察到RELMβ蛋白主要分布在肾小球系膜细胞胞浆内。高糖（25mmol/L Glu）、高脂（20mg/L LPC）、高糖联合高脂干预人肾小球系膜细胞,在6h、12h、24h、48h、72h均可显著刺激系膜细胞分泌RELMβ蛋白,且随时间延长,差异更显著（P<0.05）。高糖、高脂、高糖联合高脂干预人肾小球系膜细胞,细胞上清液中RELMβ蛋白的表达在6h或12h开始显著增加,且随时间延长,差异更显著（P<0.05）。给予70ng/ml、140ng/ml、210ng/ml不同浓度的外源性RELMβ蛋白干预人肾小球系膜细胞,观察到210ng/ml高浓度RELMβ蛋白在第二天及第三天可显著促进系膜细胞的增殖（P<0.05）,而70ng/ml及140ng/ml浓度的RELMβ蛋白对系膜细胞增殖没有明显影响（P>0.05）。[结论]RELMβ主要集中在肾小球系膜区,且在糖尿病肾病大鼠肾脏表达明显高于糖尿病大鼠及正常大鼠。高糖、高脂、高糖联合高脂均可以刺激人肾小球系膜细胞呈时间依赖性分泌RELMβ蛋白。RELMβ蛋白可以促进系膜细胞的增殖,参与2型糖尿病肾病早期的病理过程。第四部分慢病毒介导的RELMβ过表达及干扰对系膜细胞增殖凋亡及相关信号通路的调控[目的]探讨RELMβ对人肾小球系膜细胞细胞周期、增殖凋亡及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）通路的影响,探索RELMβ参与糖尿病肾病的可能细胞信号转导通路。[方法]采用慢病毒介导的过表达及RNAi技术,构建过表达及沉默RELM(3基因的稳转人肾小球系膜细胞系。CCK-8法检测人肾小球系膜细胞增殖情况,流式细胞仪检测人肾小球系膜细胞的细胞周期及细胞增殖凋亡的改变。Western blotting检测细胞MAPKs通路蛋白活性的改变。运用人信号转导通路发现者芯片筛选RELMβ可能调控的肾小球系膜细胞转导通路基因,并进行RT-PCR验证。[结果]过表达RELMβ的人肾小球系膜细胞第二天及第三天增殖显著增加,干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞第三天及第四天增殖显著抑制,给予高糖干预干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞可逆转其增殖抑制（P<0.05）。过表达RELMβ的人肾小球系膜细胞其细胞周期G0-G1期细胞数量由74.36%下降至68.80%,S期细胞数量由18.09%增加至23.20%（P<0.05）。干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞其G0-G1期细胞数量由70.69%增加至87.14%,S期细胞数量由21.63%下降至11.59%（P<0.05）,给予高糖或外源性RELMβ蛋白干预干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞,可部分逆转干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞细胞周期的改变（P<0.05）。过表达RELMβ的人肾小球系膜细胞MAPKs通路中p38MAPK和JNK的磷酸化活性增加,而ERK1/2磷酸化活性没有明显影响。干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞p38MAPK和JNK的磷酸化活性下降,而ERK1/2磷酸化活性没有明显影响。给予高糖或外源性RELMβ干预后,可逆转干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞MAPKs通路的抑制状态。给予P38MAPK通路抑制剂SB202190可以显著抑制由过表达RELMβ所引起的人肾小球系膜细胞的增殖。过表达及干扰RELMα基因对于人肾小球系膜细胞的凋亡没有明显影响。信号转导通路发现者PCR Array芯片及RT-PCR验证结果提示干扰RELMβ的人肾小球系膜细胞WISP1、IGFBP3、HK2、VEGFA、BCL2L1等基因显著下调和CXCL9、CYP19A1、 NOS2、PTGS2、TNF等基因显著上调。[结论]RELMβ可以促进人肾小球系膜细胞增殖,影响人肾小球系膜细胞的细胞周期。RELMβ可以通过调控MAPKs通路,参与早期糖尿病肾病的病理生理过程。WISP1、IGFBP3和CXCL9等可能是参与糖尿病肾病信号转导通路中重要的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 引言
• 第一部分 抗体芯片技术筛查早期糖尿病肾病相关蛋白
• 前言
• 材料及方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 血浆RELMβ与2型糖尿病微量白蛋白尿的关系
• 前言
• 实验材料及方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 RELMβ蛋白的肾脏表达定位及生物学功能
• 前言
• 实验材料及方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 慢病毒介导的RELMβ过表达及干扰对系膜细胞增殖凋亡及相关信号通路的调控
• 前言
• 实验材料及方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本课题的实验假设
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢