几种重要细菌毒素参考品候选物的制备研究

论文摘要

肉毒神经毒素（Botulinum neurotoxin, BoNT）是由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生的一种具有锌离子依赖性肽链内切酶活性的毒素蛋白,通常以复合物的形式存在,根据抗原性不同,BoNT可分为A～G 7种血清型;产气荚膜梭菌α和ε神经毒素是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）产生的四种主要外毒素中的两种,产气荚膜梭菌各型别均产生α毒素,但α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致病因子,可引起气性坏疽等症状,具有磷脂酶C、鞘磷脂酶等活性;产期荚膜梭菌ε神经毒素由B型和D型产气荚膜梭菌产生,是由311个氨基酸组成的单链多肽,ε毒素也具有多种生物活性,如神经毒性、水肿活性、致死性和肠坏死性等,是家畜肠毒血症的主要致病因子。BoNT以及产气荚膜梭菌α毒素和ε神经毒素都是重要的致死性毒素战剂和生物恐怖剂,都被列入了生物两用品进出口管制清单,因此建立这些毒素的检测和防治方法是非常必要的,但无论是建立毒素的检测方法,还是发展毒素中毒的防治手段,都离不开纯化的毒素制剂。因此,BoNT,产气荚膜梭菌α毒素和ε神经毒素参考品的制备,具有重要的军事意义和科学价值。在本研究中,首先以B型肉毒梭菌为产毒株,通过产毒培养优化,选取使菌株生长密度高,自溶好以及产毒量高的自行优化的TPOM培养基,30℃、厌氧培养96h,收取菌毒液上清,用PEG沉淀法并经全因子实验设计优化,选定20%（w/v）PEG-6000,pH 5.0和0.3 M NaCl的条件进行沉淀,以去除大量核酸以及未自溶的菌体细胞和杂蛋白,得到BoNT/B粗毒液;然后使用HiPrep Sephacryl? S-100凝胶过滤层析柱对该粗毒液进行中度纯化,保留时间最短的峰样品对应着高分子量的BoNT,将得到的活性组分再利用Phenyl HP疏水层析柱进一步精细纯化,采用梯度或阶段的洗脱方式在0.6M硫酸铵浓度下洗脱出目的蛋白。而当纯化过程中的pH值为5.8时得到BoNT/B复合物,分子量约为300kD,得率是21.5%;pH值为8.5时,可得到BoNT/B,分子量约为167kD。纯化后的BoNT/B经过SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定,纯度可达95%以上。纯化的纯品可采用Bradford法、BCA法以及紫外吸收法等三种不同原理的方法进行定量分析,样品的浓度达0.55 mg/ml,而对于不纯的样品可利用ELISA的方法进行测定。采用小鼠毒力测定实验对纯化的BoNT/B复合物进行活性分析,其腹腔注射的小鼠LD50大约为4.095 ng/kg（约为0.0901 ng /mouse）,95%的置信区间为3.0775.468 ng/kg。其次,利用重组表达技术获得产气荚膜梭菌α毒素,先以本室保存的pQE30-cpa质粒为模板,经PCR扩增出α毒素（cpa）的全基因序列（去除N端信号肽）,用EcoR I和Hind III双酶切后,再与经同样双酶切的pTIG-Trx载体连接,转化到E.coli BL21（DE3）细胞中,将在AMP抗性LB平板上的阳性克隆,分别经PCR、双酶切和测序确认正确后,表明BL21/pTIG-cpa重组表达工程菌构建成功。重组表达工程菌以1:100的比例转接,在37℃下进行扩大培养至OD600为0.60.8时,加入IPTG至终浓度为0.3 mM,在16℃下诱导过夜,目的蛋白获得可溶性表达,表达量占可溶性全菌蛋白的35%;将含有α毒素的破碎上清用螯合有Ni2+的亲和层析柱进行纯化,目的蛋白在150 mM250 mM的咪唑条件下被洗脱下来,再经过superdex 75pg凝胶过滤层析柱进一步精细纯化,得到高纯度的重组产气荚膜梭菌α毒素,SDS-PAGE电泳和RP-HPLC分析,纯度可达99%以上;重组α毒素的纯品采用Bradford法、BCA法以及紫外吸收法等三种不同原理的方法进行定量分析,样品浓度为0.955 mg/ml;经蛋白质N端测序分析,其N端的15个氨基酸分别为M-W-D-G-K-I-D-G-T-G-T-H-A-M-I,与理论氨基酸序列完全一致,证明了表达的蛋白是α毒素;体外卵磷脂酶C水解酶活性和溶血活性的试验结果表明,重组α毒素具有很好的生活学活性;重组α毒素水溶液样品在进行分装时利用方差分析法对其含量进行均匀性检验,经计算其F=0.608小于F0.05,2,12理论值3.89,表明其在95%置信区间内均匀性良好。而后对分装的α毒素样品分别放在-20℃,4℃和37℃环境中放置,活性分析结果显示α毒素水溶液存放在-20℃下活性保存最好。此外,以pET-his-etx质粒为模板,用PCR扩增出可表达活性ε神经毒素的基因（etx）。将基因和空载体pTIG-Trx分别用EcoR I和Hind III进行双酶切,然后分别回收,连接,转化到E.coli BL21（DE3）菌株中。在AMP抗性LB平板上长出的阳性克隆,分别经PCR和双酶切鉴定,并经测序确认BL21/pTIG-etx重组表达工程菌构建成功。含有pTIG-etx表达工程菌株以1:100的比例转接,在37℃下进行扩大培养至OD600为0.60.8时,加入IPTG至终浓度为0.2 mM,在16℃诱导表达过夜,目的蛋白获得可溶性表达,表达量占可溶性全菌蛋白的30%;将含有ε毒素的破碎上清首先用螯合有Ni2+的亲和层析柱进行纯化,可采用梯度或是阶段的方式进行洗脱,最终蛋白可在170 mM250 mM的咪唑条件下被洗脱下来。含有活性组分的样品再经过凝胶过滤层析superdex 75pg柱进一步精细纯化,得到高纯度的重组产气荚膜梭菌ε神经毒素。纯化后的重组ε神经毒素经SDS-PAGE电泳和RP-HPLC分析,纯度可达99%以上。重组ε神经毒素的纯品采用Bradford法、BCA法以及紫外吸收法等三种不同原理的方法进行定量,含量可达0.864 mg/ml;采用蛋白质N端测序技术获得其N端15个氨基酸的序列为M-K-A-S-Y-D-N-V-D-T-L-I-E-K-G,与理论序列完全一致,证明了表达的蛋白是ε神经毒素。此外,采用MDCK细胞,用MTS法染色分析,其半数细胞致死量（CT50）大约为80 ng/ml,说明重组的ε神经毒素具有很好的生物学活性。ε神经毒素水溶液样品在进行分装时利用方差分析法对其含量进行均匀性检验, F=0.589小于F0.05,2,12理论值3.89,表明其在95%置信区间内均匀性良好。而后对分装的ε神经毒素样品分别在-20℃,4℃和37℃环境中放置,活性分析结果显示样品存放在-20℃下活性保存最好。最终,本研究建立了一种基于PEG沉淀和层析技术相结合的天然BoNT/B纯化方法,得到了较纯的,有活性的BoNT/B参考品候选物,还建立了重组α毒素和ε神经毒素的表达与纯化工艺,获得了高纯度、有活性的产气荚膜梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε神经毒素,并初步对制备的BoNT/B、产气荚膜梭菌α毒素和ε神经毒素参考品候选物进行了定性、定量以及均匀性和稳定性等相关研究,为最终研制3种重要毒素的标准物质奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 一 肉毒神经毒素
• 二 产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素
• 三 毒素蛋白的制备
• 四 毒素蛋白标准物质
• 五 论文研究的目标
• 第一部分 B 型肉毒毒素参考品候选物的制备研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二部分 产气荚膜梭菌α毒素参考品候选物的制备研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 第三部分 产气荚膜梭菌ε毒素参考品候选物的制备研究
• 引言
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢