论文摘要
异质性胞核核糖核蛋白A2/B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1）是一种癌生长蛋白,与肺癌的发生发展密切相关。研究表明,hnRNP A2/B1在所有正常细胞中存在低水平表达,在肺癌发生早期呈现hnRNP A2/B1表达异常,随着肿瘤的生长,hnRNP A2/B1的表达水平在达到高峰后有所下降,但仍维持一定水平的表达。目前多采用IHC（免疫组化）法和经典的RT-PCR法,分别从蛋白质水平和mRNA水平对hnRNP A2/B1进行定性或半定量检测。本研究采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）方法,就hnRNP A2/B1在肺癌患者与其他人群之间存在的hnRNP A2/B1表达水平差异进行定量研究,并探讨其在肺癌诊断中的应用价值。 一、FQ-RT-PCR检测hnRNP A2/B1外周血中定量方法的建立 近年来,有研究报道,在实体肿瘤患者的外周血中,除了可以检测到循环的肿瘤脱落细胞外,在血浆和血清中还可检测到自由循环的核酸。本课题尝试分离出肺癌患者外周血中肿瘤脱落细胞或完整细胞外肿瘤相关mRNA,并对其进行扩增研究,建立了基于RT-PCR的扩增系统。本研究采用基于ABI5700荧光定量PCR系统的TaqMan探针技术,对外周血中hnRNPA2/B1表达水平进行绝对定量。具体方法是采用浓度已知的DNA作为标准品建立标准曲线,与未知样本在同一反应板上同时定量,标准曲线为6个点。在建标准曲线同时,确定实时PCR的扩增效率;同时优化反应条件,使扩增效率尽量接近100%。以β-actin作为参比对照,即阳性平行对照（Parallel Positive Control, PPC）。目标基因和参比基因在平行反应管内同时进行定量测定。对定量结果进行标化的方法为:[DNA]样本/[DNA]PPC,或者DCt=Ct（样本）-Ct（PPC）。因为Ct值与起始DNA拷贝数的对数是反比关系,
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