论文摘要
目的:探讨胆固醇合成抑制剂辛伐他汀（Simvastatin, SIM）对人神经胶质瘤（U251）细胞体外抗增殖和诱导凋亡作用,并探讨其可能的分子机制。方法:选取人神经胶质瘤细胞系U251,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测SIM不同浓度组（1、5、10、20、30、40、50、60μg/ml）、不同时间组（24、48、72、96h）对细胞存活和生长的影响情况,从而选择适当的药物浓度及作用时间。根据MTT的结果,设置对照组及实验组（5、10、20μg/ml）。流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定SIM对U251细胞周期分布和凋亡的影响,光学显微镜和Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态学改变。分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR,RT-PCR）半定量检测SIM处理前后U251细胞中Survivin、Bax mRNA的表达水平。采用流式细胞术半定量检测SIM处理前后U251细胞中Survivin及Bax蛋白的表达水平。结果:1 MTT结果显示:SIM（1、5、10、20、30、40、50、60μg/ml）对U251细胞具有抑制增殖的作用。不同浓度SIM处理细胞2496h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度下降,差异具有显著性（P<0.05）。且随着SIM处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降,即SIM对U251细胞的增殖抑制作用有明显的剂量—效应和时间—效应依赖关系。SIM处理细胞24、48、72、96h,IC50分别为19.25μg/ml、9.74μg/ml、5.75μg/ml、3.52μg/ml。2 SIM作用U251细胞后,有明显的细胞形态学改变:细胞缩小,细胞核固缩,细胞突起减少,胞体折光性减弱,胞浆内可见有颗粒。随SIM浓度和处理时间延长,细胞可变圆脱壁,部分细胞胀大破裂。同时可见到细胞凋亡的形态学改变:细胞皱缩破裂呈不规则形,在细胞周围有放射状分布的点片状细胞碎片,有的细胞胞浆中出现空泡。随着药物浓度增加和作用时间延长,细胞破碎增多,培养液中可见到大量细胞碎片。荧光显微镜下观察,10μg/ml SIM处理U251细胞2d后出现核固缩,DNA浓缩并向核膜靠近,核浆比例减小及胞膜皱缩等早期凋亡形态学变化;部分细胞因DNA断裂,细胞核表现为片状或点状,出现凋亡小体。3流式细胞术检测U251细胞周期分布和凋亡显示,0、5、10、20μg/ml SIM作用U251细胞48h后,随药物浓度增大,G0/G1期细胞逐渐增多;S期和G2/M期细胞则逐渐减少。即SIM可阻滞U251细胞周期进程于G0/G1期,该作用呈剂量—效应依赖关系。0、5、10、20μg/ml SIM作用U251细胞48h、72h后,出现典型的亚二倍体凋亡峰,依SIM浓度增大而逐渐升高;最大凋亡率为21.63%。流式细胞仪间接分析Survivin及Bax蛋白表达显示,0、5、10、20μg/ml SIM作用U251细胞48h后,Survivin的荧光指数FI值随处理浓度增大而逐渐减小;Bax的FI值随处理浓度增大而逐渐增大。对于每一种蛋白,比较其处理组和对照组的FI值,差异具有显著性（P<0.05）。4半定量RT-PCR检测结果显示:SIM处理前U251细胞Survivin、Bax基因均表达阳性。与对照组相比,经SIM处理的U251细胞中Survivin mRNA表达明显降低（P<0.05）,Bax mRNA表达明显升高（P<0.05）。经SIM处理48h后,20μg/ml组Survivin/β-actin光密度比值由对照组的0.944±0.018降至0.237±0.009;Bax /β-actin光密度比值由对照组的0.219±0.015升至0.939±0.012。结论:1本实验首次通过体外实验证实了HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀（SIM）具有抗人神经胶质瘤U251细胞的作用,为人神经胶质瘤的治疗提供了新的理论依据。2 SIM在一定浓度范围内,能够直接抑制U251细胞增殖,并呈时间—剂量依赖关系。3本实验证实SIM可阻滞U251细胞于G0/G1期并可诱导该细胞凋亡。4一定浓度的SIM能够在mRNA转录水平和蛋白水平抑制U251细胞中Survivin表达、提高Bax表达。我们初步推论SIM通过下调Survivin mRNA及蛋白的表达和上调Bax mRNA及蛋白的表达而发挥其抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖、诱导凋亡的作用。5本实验揭示由细胞凋亡介导的SIM的抗肿瘤作用及其分子机制,为其临床应用提供理论依据和实验基础。