Caveolin-1特异性siRNA对乳腺上皮细胞雌激素受体α信号转导通路的影响

论文摘要

乳腺癌是一种常见的妇科肿瘤,近20年来在我国的发病率逐渐升高,已严重威胁女性的健康。乳腺癌的发生是一个多阶段、多因素参与的过程。许多证据表明,雌激素刺激是乳腺癌发生的一个重要的致病因子。雌激素的活性主要是受雌激素受体（ER）的调节,雌激素受体是核受体家族的成员,并且作为配体激活型转录因子调节雌激素应答基因的表达水平。ERα有三种亚型:ERα-66,ERα-46和ERα-36。核内的ERα-66的活化可以较大程度的影响17β-雌二醇（E2）诱导的雌激素依赖性乳腺细胞的增殖。在正常乳腺上皮细胞中,ERα-66处于一个较低的表达水平,但是在向乳腺癌转化的过程中,其表达水平发生明显的上调。然而,在这一过程中,促使ERα-66表达发生明显升高的分子机制尚不清楚。此外,另有研究表明ERα-66和ERα-46可以影响NO的合成。ERα-36是一种新型的ERα亚型,它作为一种膜受体,可以影响雌激素和抗雌激素引起的细胞增殖。ERα-36调节膜起始的雌激素和抗雌激素信号转导的分子机制已成为近年来关注的热点。Caveolae是细胞质膜内陷形成的凹陷小窝,其标志性蛋白——Caveolin-1（Cav-1）常作为肿瘤抑制因子行使多种细胞功能。值得关注的是,在ERα阳性乳腺癌中,常伴有Cav-1的显性缺失突变。并有临床研究表明,在Cav-1缺失的乳腺上皮细胞中,ERα的表达发生明显上调。可见,Cav-1与ERα表达水平有着密切的关系。另有证据表明,在质膜上也存在ERα-66的表达,并且其就定位在Caveolae上。在乳腺癌（MCF-7）细胞中,Cav-1过表达可促使胞质中的ER转位到质膜上。另外,早期研究表明,E2可以与膜上的受体结合并引发cAMP的快速产生。之后,又有研究表明,定位在质膜上的雌激素受体可以诱导膜起始的雌激素介导的信号转导通路的发生。这一膜起始的信号转导通路可以激活许多胞质内的信号转导相关蛋白的表达及膜雌激素起始的信号通路的活化,主要包括腺苷酸环化酶,G蛋白偶联受体,促有丝分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰3激酶等信号转导通路。作为肿瘤抑制因子,在乳腺上皮细胞中,Cav-1表达下调对乳腺癌早期转化和ER介导的信号转导通路的作用机制还需要进一步的深入研究。本实验以利用基因捕获技术获得的Cav-1单倍不足细胞株（MCF10A-ST1,MCF 10A-ST3）和其母细胞株MCF 10A为研究对象,应用免疫共沉淀技术检测Cav-1与ERα之间的相互作用关系,小RNA干扰技术沉默乳腺上皮细胞Cav-1表达,利用Western Blot检测了ERα及其介导的信号转导通路相关蛋白的表达水平,探讨Cav-1的表达水平与ER介导的信号转导通路的关系及其可能的分子机制。旨在阐明Cav-1在人正常乳腺细胞早期转化中的部分作用机制,为进一步揭示乳腺癌发病机理提供直接的科学依据。结果如下:（1）利用siRNA干扰技术,我们成功建立了Cav-1基因沉默细胞模型——7SD8;（2）在MCF 10A和ST3细胞中,Cav-1与ERα均具有相互作用关系,并且随着Cav-1表达不断下降,Cav-1与ERα之间的结合能力越来越强;（3）在瞬时转染MCF 10A细胞96小时后,Cav-1表达发生明显降低,并且随着Cav-1表达不断下降,ERα-66的表达明显升高,而ERα-36的表达却是先下降后又重新升高;（4）在瞬时转染ST1细胞时,随着转染时间的不断增加,Cav-1蛋白的表达水平不断下降;（5）在Cav-1进一步下降的过程中,磷酸化ERK蛋白的表达量在瞬时转染ST1细胞48小时和72小时后发生明显的增加,在96小时后又恢复正常,而总ERK1/2蛋白的表达水平无明显变化,并且在7SD8细胞株中我们同样检测到较高水平的磷酸化ERK1/2蛋白的表达;（6）磷酸化AKT蛋白的表达在转染72小时后发生明显上调,而总AKT蛋白的表达也在转染48小时后发生明显上调,同时其上游分子PI3K蛋白的表达在转染48h和72h时也发生明显上调,其下游分子P21蛋白的表达在转染48小时和96小时后发生明显降低。（7）在Cav-1表达短暂下调的过程中,细胞周期蛋白Cyclin D1的表达水平并无明显变化。结论:（1）Cav-1蛋白与ERα存在相互作用关系,并且Cav-1表达下调不但可以影响二者之间的相互结合能力,同时还可以激活ERα的表达,进而促进乳腺上皮细胞向癌细胞转化。（2）Cav-1蛋白表达下调可以激活ER介导的信号转导通路,如Ras-MAPK和PI3K/AKT的活化,导致细胞逃避凋亡而发生过度增殖,促进乳腺上皮细胞的早期转化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1. Caveolae 的结构和功能
• 1.1 Caveolae 的结构特征
• 1.2 Caveolae 的标志性蛋白——Caveolins
• 1.3 Caveolin-1 蛋白的结构及功能特点
• 2. 乳腺细胞中雌激素受体（ER）的分类及其功能结构特征
• 3. 质膜雌激素受体mER 的发现及其行使的生物学功能
• 3.1 质膜雌激素受体mER 的发现
• 3.2 质膜雌激素受体 mERα 新亚型的发现及其行使的生物学功能
• 4. 膜雌激素受体（mER）的细胞亚定位
• 5. Caveolin-1 与mER 介导的信号转导通路的关系
• 5.1 Caveolin-1 与mER 介导的ERK/MAPK 信号转导通路的关系
• 5.2 Caveolin-1 与 mER 介导的 PI3K/AKT 信号转导通路的关系
• 6. 展望
• 参考文献（References）
• 第二章 Caveolin-1 基因沉默细胞模型的建立
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.1.1 主要试剂配置
• 1.2.1.2 细胞培养条件
• 1.2.2 siRNA 的稳定转染
• 1.2.2.1 siRNA 转染质粒的获得（碱裂解法）
• 1.2.2.1.1 主要试剂配置
• 1.2.2.1.2 细菌的培养和收集
• 1.2.2.1.3 质粒DNA 快速提取
• 1.2.2.1.4 电泳凝胶的配制
• 1.2.2.1.5 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.2.1.6 质粒DNA 的酶切鉴定
• 1.2.2.1.7 DNA 浓度的测定
• 1.2.2.2 目的质粒的转染
• 1.2.3 蛋白样品制备与定量
• 1.2.3.1 主要试剂配置
• 1.2.3.2 蛋白提取
• 1.2.3.3 蛋白定量
• 1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.4.1 主要试剂配制
• 1.2.4.2 胶的制备
• 1.2.4.3 样品的制备
• 1.2.4.4 电泳
• 1.2.5 蛋白质免疫印迹（Western Blot）
• 1.2.5.1 主要试剂配置
• 1.2.5.2 免疫印迹
• 1.2.5.2.1 转膜
• 1.2.5.2.2 封闭
• 1.2.5.2.3 一抗结合
• 1.2.5.2.4 二抗结合
• 1.2.5.2.5 ECL 显色
• 1.2.6 MTT 法测定细胞倍增时间
• 1.2.7 统计分析
• 2 结果
• 2.1 Caveolin-1-siRNA 质粒的扩增和鉴定
• 2.2 Cav-1 基因沉默细胞模型的建立
• 2.3 Cav-1-siRNA 特异性抑制乳腺上皮细胞Cav-1 蛋白的表达
• 2.4 Cav-1 基因沉默对乳腺上皮细胞增殖的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献（References）
• 第三章 Cav-1 特异性 siRNA 对不同雌激素受体亚型表达的影响
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 主要仪器（同第二章，略）
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养（同第二章，略）
• 1.2.2 siRNA 的瞬时转染
• 1.2.2.1 siRNA 转染质粒的获得（碱裂解法）（同第二章，略）
• 1.2.2.2 目的质粒的转染
• 1.2.3 蛋白样品制备与定量（同第二章，略）
• 1.2.4 蛋白质免疫共沉淀
• 1.2.5 Western Blot（同第二章，略）
• 2 结果
• 2.1 MCF 10A 和 ST3 细胞中 Cav-1 与 ERα 的相互作用的比较
• 2.2 Cav-1-siRNA 瞬时转染对 MCF10A 细胞 ERα 表达的影响
• 8）ERα 的表达'>2.3 Caveolin-1 基因沉默模型（7SD₈）ERα 的表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献（Reference）
• 第四章 Cav-1 特异性 siRNA 对 ER 介导的信号转导通路的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 主要仪器（同第二章，略）
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 蛋白样品制备与定量（同第二章，略）
• 1.2.3 siRNA 的瞬时转染
• 1.2.3.1 siRNA 转染质粒的获得（碱裂解法）（同第二章，略）
• 1.2.3.2 目的质粒的转染
• 2 结果
• 2.1 Cav-1 特异性 siRNA 对 Ras-MAPK 信号转导通路的影响
• 2.2 Cav-1 特异性 siRNA 对 PI3K/AKT 信号转导通路的影响
• 2.2.1 Cav-1 特异性 siRNA 对 PI3K 蛋白表达水平的影响
• 2.2.2 Cav-1 特异性siRNA 对AKT 表达水平的影响
• 2.2.3 Cav-1 特异性siRNA 对P21 表达水平的影响
• 2.3 Cav-1 特异性 siRNA 对 Cyclin D1 表达水平的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献（References）
• 结论
• 附件1
• 致谢
• 作者简介