论文摘要
目的:由于HIV-1本身具有快速复制及高突变率的特点,在宿主的选择压力及药物的选择压力下,HIV感染者体内存在高度复杂多样且动态变化的病毒准种。目前常用的病毒分离方法均为共培养法,此法分离得到的仅为个体内准种中一株或几株优势毒株,一些相对弱势株会丢失,不能得到完整的多样的病毒描绘。目前国外学者已经建立了通过有限稀释共培养获得生物性克隆HIV-1毒株的方法。本实验运用有限稀释共培养方法从我国艾滋病感染者体内分离单克隆的HIV-1毒株,旨在丰富及发展我国HIV的病毒分离方法,并通过分析生物克隆病毒感染、复制能力以及基因序列的变异,验证分离方法的正确性与可行性。迄今,被美国FDA批准的抗艾滋病药物有27种,只有5种药物用于我国艾滋病患者免费抗病毒治疗,耐药毒株的出现和药物的毒副作用,导致艾滋病患者抗病毒治疗失败,因此寻找高效、低毒的抗HIV-1的药物是当前HIV治疗中面临的机遇与挑战,我国具有丰富的植物资源,中草药在抗HIV中的应用已有广泛报道。通过研究藏药蕨麻提取物的抗HIV-1活性以及其对相应细胞的毒性作用,为开发我国自主产权的抗艾滋病药物提供可能。方法:从新疆及北京HIV-1感染者中选择治疗人群和未治疗人群作为样本,通过有限梯度稀释感染者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）后进行共培养的方法,根据分离阳性率来选择性地分离生物性克隆的HIV-1毒株;利用P24抗原检测试剂盒定性的检测病毒分离情况,同时定期定量检测病毒P24抗原的释放,分析各生物性克隆的HIV毒株间感染及复制能力的差异,同时扩增培养上清中HIV-1 V1-V5区基因,并测序分析,比较各生物性克隆的HIV毒株间氨基酸序列的差异及联系,从而验证生物性克隆分离方法的可行性。藏药蕨麻提取物由本科室提取,分别用TZM-bl、MT-4和PBMCs检测提取物的毒性作用,对于TZM-bl和MT-4细胞系,分别采用CCK-8试剂及快速细胞分析仪（CASY-TT）检测各浓度下细胞的存活数量,对于PBMCs仅选用CCK-8法检测,并运用Reed- muench法计算蕨麻提取物对于以上细胞的50%细胞毒性剂量（50% cytotoxicity concentrations CC50）。抗HIV-1活性实验,分别在TZM-bl、MT-4细胞系和PBMCs进行蕨麻提取物对HIV-1实验室适应株（SF33）的抑制实验,用100TCID50（50% Tissue culture infective dose 50%组织细胞感染剂量）感染细胞,同时,蕨麻提取物以40,20,10,5,2.5,1.25μg/mL浓度加入细胞,分别在感染3天或7天后,利用荧光和HIV P24检测试剂盒检测病毒进入细胞并复制状况,并运用Reed-muench法计算蕨麻提取物对SF33的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration IC50）。并进一步分析蕨麻提取物对于我国HIV-1临床分离株和HIV假病毒的抑制作用。结果:1运用有限稀释共培养法,成功地从个体艾滋病患者PBMCs中分离出多株病毒,实现了微量HIV-1的分离。2分离得到的系列病毒,在扩大培养过程中,总体呈增长趋势,说明采用此法分离的HIV毒株具有感染能力;在相同分离及复制条件下,各病毒在不同时间点产生的P24抗原含量存在差异,说明个体内各毒株的感染能力及复制能力具有差异。3通过分析病人体内毒株间env区中的V1-V5区的氨基酸序列,各生物性克隆HIV-1毒株间存在氨基酸的变异、插入及缺失,从基因水平证实了准种理论。4采用CCK-8试剂检测蕨麻提取物对PBMCs的（CC50）为92.5μg/mL,对TZM-bl细胞的CC50为147.5μg/mL,对MT-4上的CC50为163.4μg/mL,使用CASY方法检测的蕨麻提取物对TZM-bl细胞的CC50为220μg/mL,对MT-4的CC50为153.9μg/mL。5蕨麻提取物在PBMCs和TZM-bl和MT-4细胞上对SF33的IC50分别是IC50分别为和4.02μg/mL、4.67μg/mL和6.17μg/mL;对两株我国临床分离株的IC50平均为1.99μg/mL ,对于4株HIV假病毒的平均IC50为2.43μg/mL。结论:1采用有限稀释、梯度稀释病人PBMCs后共培养方法,根据各梯度下阳性率,可在某稀释度下分离得到由单个感染的细胞产生的HIV-1毒株,即生物性克隆的HIV-1毒株2个体内分离获得的一系列的生物性克隆毒株复杂多样,在结构和生物学性质上存在差异3蕨麻提取物在体外具有抗HIV-1的作用,蕨麻提取物对HIV-1实验室标准株,临床分离株,假病毒均有抑制作用,其IC50在1.99到6.17之间。4蕨麻提取物的抗HIV-1作用机制不只为已知成分中报道的抑制HIV蛋白酶,其有效部位群中可能存在作用于HIV生命周期中的进入或者逆转录的过程的成分。