论文摘要
目的：本课题研究目的是开发中药青风藤中对抗阿片类药物依赖、治疗戒断症状的天然有效成分，并进行初步的药效学研究。采用正交设计法优选切合实际的最佳制剂工艺。质量控制方面将对青风藤中所含主要活性成分青藤碱进行薄层色谱定性鉴别的研究，并采用高效液相色谱法进行含量测定研究，初步确定其含量限度。对本研究所采用的含量测定方法进行方法学研究，制订控制该制剂质量的质控指标。通过急性毒性试验，观察青风藤提取物对小鼠的急性毒性反应及死亡情况，为该药临床应用的安全性提供科学依据。通过动物模型，观察青风藤提取物对吗啡依赖大、小鼠催促戒断症状的治疗作用，为青风藤提取物的临床应用提供药理学依据。方法：1．青风藤提取工艺考察实验：对有效成分含量影响较大的因素有煎煮时间、煎煮次数、作为溶剂的乙醇浓度，加入溶剂的量等。根据青藤碱既溶于水又可溶于醇的特性，选用不同浓度的乙醇为溶剂，将乙醇浓度和煎煮时间、次数及溶液用量构成四个主要影响因素，每因素各设3水平，因此，选用L9（34）正交设计表。按正交表中给定的实验条件进行正交试验，重复3次，以平均青藤碱的含量（mg／ml）为考察指标筛选最佳条件。2青风藤提取工艺验证实验：按最佳工艺验证3批，取相当与1g生药量的干膏测青藤碱的含量。3青风藤定性鉴别实验：照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部，附录ⅥB）试验，吸取青风藤成品供试品溶液10μl，青风藤对照药材溶液10μl，青藤碱对照品溶液5μl，分别点于同一2％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-甲醇-乙酸乙酯-水（2∶2∶4∶1）10℃以下放置的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。依次喷碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。4青风藤含量测定波长选择：按色谱条件对对照品溶液和样品溶液进行检测，根据青藤碱对照品和样品中青藤碱的紫外吸收图谱，确定青藤碱最大吸收波长。5青藤碱对照品标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液5、10、15、20、30μl，在高效液相色谱仪中进行测定，以峰面积为纵座标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。6精密度实验：精密吸取青藤碱对照品溶液10μl，重复连续进样5次，测定供试品中青藤碱的峰面积值。7稳定性试验：取供试品溶液，分别在制备后0、2、16、18、22小时进行青藤碱峰面积测定，每次进样10μl。8重现性试验：同一批样品干膏精密称取样品1g，共5份，制备成供试品溶液，按选定的方法测定，每次进样10μl。9回收率测定：取青风藤干膏共5份，分别精密称取1g，按样品含量测定方法测定其青藤碱的含量，精密加入青藤碱对照品（青藤碱含量为2.722mg／m1）1ml，计算青藤碱的回收率。10样品中青藤碱的含量测定：取本品，胺照供试品溶液制备方法制备，按选定的方法，自动进样供试品溶液10μl，测定供试品溶液中青藤碱的峰面积值，计算含量。11青风藤提取物急性毒性试验：取昆明小鼠40只，♂♀各半，随机分成2组（n=20），即空白对照组、青风藤提取物组。2组动物经禁食12h（饮水不限）后，分别ig给予等容量生理盐水和青风藤提取物药液，在一天内连续给药两次（9：00，18：00），给药后小鼠自由进食饮水。药后24小时内严密观察受试动物的情况，以后每天观察3次，连续14天，于第15天称体重后将小鼠处死，解剖后肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器的病理学改变。12对吗啡依赖动物催促戒断症状的治疗实验：（1）青风藤提取物对吗啡依赖大鼠戒断症状的治疗实验按剂量递增法造成吗啡依赖大鼠模型。取SD大鼠60只，雌雄各半，sc吗啡，每天3次（8：00、14：00、20：00），剂量为5、10mg／kg各4天，15、20mg／kg各3天。注射量为0.2ml／100g。于第15天上午8：00将大鼠随机分为6组，每组10只，然后分别给予不同的处理：①组为续用吗啡组，20mg／kg／日，（0.2ml／100g）；②组为戒断模型组，ig等容量的生理盐水；③-⑤分别为青风藤提取物低、中、高剂量组，分别ig青风藤提取物0.4g／kg、0.8g／kg和1.6g／kg的药液，各组给药体积相同（1ml／100g），但浓度不同；⑥组ig青藤碱45mg／kg。给药45min后用纳洛酮（4mg／kg，ip）进行催促，观察记录大鼠的戒断反应，并于60min时称量大鼠体重。（2）青风藤提取物对吗啡依赖小鼠戒断症状的治疗实验按剂量递增法复制吗啡依赖小鼠模型。取昆明小鼠100只，雌雄各半，每天给予sc吗啡，每天给药2次（8：30，16：30），给药体积为0.2ml／10g。剂量从25mg／kg起，逐日递增，于第6天增至150mg／kg，即制成吗啡依赖的小鼠模型。于第7天进行纳洛酮催促戒断试验。各组分别给予不同的处理：①组为空白对照组，ig等体积生理盐水（0.2ml／10g）；②—④分别为青风藤提取物低、中、高剂量组，按各组剂量0.8g／kg、1.6g／kg和3.2g／kg，ig给药，给药体积相同（均为0.3ml／10g），浓度不同；⑤组ig青藤碱（60mg／kg）。药后45min给予纳洛酮（8mg／kg，ip）催促，观察30min内小鼠出现的跳跃次数及1h内的体重变化。结果：1．经筛选的最佳制剂工艺为：处方药材加8倍量70％乙醇，提取2次，每次2h。2按最佳工艺验证3批，取相当与1g生药量的干膏测青藤碱的含量，结果青藤碱含量基本稳定，说明工艺较稳定。3经筛选的最佳制剂工艺所得成品中青风藤色谱斑点清晰，与对照品斑点的位置和颜色均一致。4根据青藤碱对照品和样品中青藤碱的紫外吸收图谱，在262nm处有最大吸收，故选定262nm为青藤碱的检测波长。5测定结果表明，青藤碱对照品在进样量2.57μg～15.42μg范围内呈良好的线性关系。6 RSD（％）=0.99，结果表明精密度良好。7结果表明供试品溶液在制备后22小时内稳定。8重现性好RSD（％）=1.66，结果表明，本法测定青藤碱的重现性良好。9回收率为99.49％，RSD（％）=0.66，根据含量测定结果，表明回收率结果良好。10含量测定结果，本品每1g含青风藤以青藤碱(C19H23NO4)计，不得少于4.4mg。11青风藤提取物以最大浓度、最大给药容积一天两次ig给药后，观察14天未见动物死亡。12 （1）青风藤提取物3个剂量组的戒断症状分值均低于戒断模型组，其中中、高剂量组的戒断症状分值略高于单体青藤碱组，但无明显差异，P＞0.05。（2）给小鼠连续sc吗啡6天后，经纳洛酮催促，空白对照组小鼠出现明显的跳跃反应，跳跃小鼠为100％。青风藤提取物ig给药后，各剂量组小鼠出现跳跃反应的个数及次数均有所减少，与空白对照组比较，中、高剂量组及单体青藤碱组均显著减少，P＜0.05。青风藤提取物高剂量组与青藤碱组比较，P＜0.05，差异显著。结论：1．工艺验证实验结果表明青藤碱含量基本稳定，说明优选工艺较稳定。2．根据方法学研究结果，试验证明，该含量测定方法准确度高重现性好，因此可采用本法测定青风藤提取物中青藤碱的含量。3青风藤提取物对小鼠的最大日给药剂量为64g／kg，相当于临床成人日用剂量的914倍。表明本品是一种低毒、安全的中药制剂。4吗啡依赖大鼠催促戒断治疗实验结果表明，青风藤提取物3个剂量组在戒断症状最重的前三天均能明显抑制戒断大鼠的戒断症状和体重下降。5青风藤提取物对吗啡依赖小鼠催促戒断症状具有治疗作用，能抑制吗啡依赖小鼠催促戒断的跳跃反应及戒断时的小鼠体重下降。
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