贵州绿僵菌产壳聚糖酶的纯化鉴定及高产菌株的诱变选育

论文摘要

甲壳素是地球上数量最大的含氮有机化合物，据估计自然界每年生物合成的甲壳素近100亿吨。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基的产物。近年来发现壳聚糖的低聚糖（壳寡糖）有重要的生物活性，尤其是六糖和七糖在抑制肿瘤方面的作用令人鼓舞。用专一性的壳聚糖酶（Chitosanase）水解胶体壳聚糖，控制反应条件，可获得含五糖和六糖较高的低聚糖。目前国内外真菌源壳聚糖酶的报道主要集中在曲霉属、青霉属和球孢白僵菌等，其纯化方法也多采用盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析等方法。寻找壳聚糖酶新酶源、简化壳聚糖酶的纯化工艺、利用理化因子诱变选育高产壳聚糖酶菌株极具研究价值。本研究在本实验室前期筛选到产壳聚糖酶活性较高的贵州绿僵菌AS 3.4608，并对其进行低成本的固态发酵的基础上，对贵州绿僵菌AS 3.4608固态发酵物提取液采用两步层析进行分离纯化，即采用自制交联壳聚糖树脂亲和吸附壳聚糖酶后用Cu2+洗脱，再以Superdex 75层析分离，经SDS-PAGE证实获得了电泳纯的壳聚糖酶，比活达106.39U／mg，每克干培养基可获壳聚糖酶328ug，活性回收率为43.25％，酶蛋白分子量为50.3KD。对样品理化性质研究表明，该酶在45℃以下有较好的稳定性，在弱酸性（pH 5.0-7.0）的溶液中也相当稳定。该壳聚糖酶降解壳聚糖反应最适温度为50℃，最适pH为4.0。其米氏常数Km值为2.718g／L，Vmax为1.152×10-2g·L-1·min-1。Hg2+对该酶有强烈抑制作用，Mn2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ag+对其有较强抑制作用，Cu2+对其有较强激活作用。该酶是一种糖蛋白，含糖量约为26.33％。该酶最适底物为脱乙酰度为90％的胶体壳聚糖。本研究采用紫外线和氯化锂对贵州绿僵菌AS 3.4608进行复合诱变，筛选到了一株遗传稳定、产酶活力高的菌株Y0320。并对其发酵培养基进行了优化研究，经L9（33）正交实验，最终确定其最佳发酵条件为：以黄豆粉∶麸皮=2.5∶1为培养基，添加22.5％的稻壳增加通气，添加3.25％的壳聚糖作为诱导物，经27℃～28℃培养120小时，每克干培养基产壳聚糖酶活力达600U，比野生菌株贵州绿僵菌AS3.4608（每克干培养基产壳聚糖酶活力可达83U）产酶活力增加6倍。本研究探索的简便的纯化壳聚糖酶方法和诱变选育到的稳定高产壳聚糖酶菌株有潜在工业化应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 贵州绿僵菌产壳聚糖酶的纯化及性质研究
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.1.3 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 贵州绿僵菌的固态发酵
• 1.2.2 壳聚糖酶的纯化
• 1.2.2.1 固态发酵粗酶液的制备
• 1.2.2.2 亲和层析
• 1.2.2.3 Superdex 75层析
• 1.2.3 壳聚糖酶的性质
• 1.2.4 壳聚糖酶活力测定方法
• 1.2.5 蛋白质浓度测定方法
• 1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3 结果
• 1.3.1 粗酶液壳聚糖酶活力
• 1.3.2 壳聚糖酶的分离纯化
• 1.3.2.1 亲和层析
• 1.3.2.2 Superdex 75层析
• 1.3.2.3 壳聚糖树脂再生
• 1.3.3 壳聚糖酶的性质研究
• 1.3.3.1 温度对壳聚糖酶活力的影响
• 1.3.3.2 pH对壳聚糖酶活力的影响
• 1.3.3.3 金属离子对壳聚糖酶活力的影响
• 1.3.3.4 壳聚糖酶的底物专一性
• 1.3.3.5 壳聚糖脱乙酰度对壳聚糖酶活力的影响
• 1.3.3.6 壳聚糖酶分子量测定
• 1.3.3.7 壳聚糖酶含糖量的测定
• 1.3.3.8 壳聚糖酶降解反应作用方式研究
• 1.3.3.9 壳聚糖酶的表观米氏常数的测定
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二部分 高产壳聚糖酶菌株的诱变选育
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种选育流程
• 2.2.2 诱变菌液的制备
• 2.2.3 紫外线诱变
• 2.2.4 复合诱变
• 2.2.5 遗传稳定性试验
• 2.2.6 诱变菌最适产酶培养条件的研究
• 2.2.7 胶体壳聚糖的制备
• 2.2.8 透明圈比值测定
• 2.2.9 壳聚糖酶活力检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 紫外线诱变
• 2.3.2 紫外线与氯化锂复合诱变
• 2.3.3 筛选到的产壳聚糖酶活力较高的诱变菌株
• 2.3.4 诱变后菌株形态分化
• 2.3.5 固态发酵中单因素影响实验
• 2.3.6 正交实验结果
• 2.3.7 诱变菌Y0320V的产酶曲线
• 2.3.8 诱变菌Y0320V产壳聚糖酶能力与贵州绿僵菌AS3.4608的比较
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间科研成果简介
• 文献综述及其参考文献