论文摘要
研究背景和目的高血压是一种由遗传和环境中多种病因引起的可致全身多个靶器官损害的进行性发展的临床综合症,是心脑血管疾病发生发展致死致残的罪魁祸首。在高血压及其靶器官损害的病理生理过程启动和维持机制中,肾素血管紧张素醛固酮系统占有重要的地位,其中血管紧张素II是核心效应分子,作为循环激素或以自分泌和旁分泌激素的形式,主要通过组织细胞上血管紧张素受体1（AT1）途径发挥一系列生物学作用。血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等药物的临床应用及循证医学资料充分证实了这一理论。尽管已有几类药物可供选择用来治疗高血压,但仍有许多病人的血压得不到良好的控制,以及由于药物本身的副作用,每日甚至每日多次给药的麻烦,药物的价格昂贵等,许多患者治疗的顺应性差。随着二十世纪末医学分子生物学的快速发展,基因治疗的设想和研究应运而生,特异性的调控某一致病基因可望提供较长时期的治疗效果。人们对高血压病的基因治疗也已经进行了有益的探索,概括起来有两种策略,一种是上调舒血管因子的表达,一种是下调缩血管因子或其受体的表达。RNA干扰技术是近几年才被认识和研究应用的一种基因下调技术。我们选择功能明确的大鼠血管紧张素II1a型受体（AT1aR）基因作为靶点,试用RNA干扰技术下调原代培养的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）和乳鼠心肌细胞（NRVMs）上血管紧张素II1a型受体（AT1aR）的表达,并检验其对VSMCs细胞活性及增殖的影响,继而观察其对肾血管性高血压大鼠血压及其心肌肥厚重构的作用,初步探索其作为高血压病及其靶器官损害防治的基因干预手段的可能性。研究方法1.设计针对大鼠AT1a受体的两个RNA干扰靶序列,分别对应于AT1a mRNA上928-946和978-996位点,构建携带U6启动子和相应序列的短发夹RNA（shRNA）模板的质粒载体pAT1a-shRNA1, pAT1a-shRNA2,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con（pCon）为对照,进行后续体外和体内实验。2.体外实验:用上述两种RNA干扰质粒pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2或对照质粒pCon转染原代培养的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）和乳鼠心肌细胞（NRVMs）,分别通过半定量RT-PCR和Western blot法检测AT1a,AT2受体mRNA和蛋白质的表达情况,以内参照β-actin进行标化。用四甲基氮唑盐（MTT）比色法（测A490nm值）检验两种RNA干扰质粒对VSMCs细胞活性及AngII促VSMCs增殖效应的影响。3.体内实验:用两肾一夹（two-kidney, one-clip:2K1C）方法构建肾血管性高血压大鼠模型,随机分成5组,每组6只,pAT1a-shRNA1组、pAT1a-shRNA2组、pCon组（分别单次尾静脉注射RNA干扰质粒pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2和对照质粒pCon）;缬沙坦（Valsartan）组（予选择性AT1受体拮抗剂缬沙坦,每日灌胃给药,30mg·kg-1·d-1）, Blank组（空白对照:不予任何治疗）。三周后检测尾动脉压变化和颈动脉压水平、左室收缩舒张功能、处死动物,测量计算左心室重量与体重之比（LV/BW）,对左心室和胸主动脉进行组织病理学检查,并用Western-blot分析心肌和主动脉组织AT1受体表达情况。另取18只同龄雄性健康SD大鼠,随机平均分成3组。其中,正常未干预空白对照（Normal blank）组:不予任何干预,提供正常健康成年大鼠的各相关生理功能指标的参考值;Normal pAT1a-shRNA1、Normal pAT1a-shRNA2组:分别给予单次尾静脉注射RNA干扰质粒pAT1a-shRNA1和pAT1a-shRNA2,检查其给药前后的血压变化,初步评价RNA干扰质粒的安全性。实验结果1.成功构建shRNA表达质粒pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2,和pGenesil-Con（pCon）,扩增和纯化获得理想的质粒产品。2.体外细胞学实验:RNA干扰质粒pAT1a-shRNA1使大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低82%和69%,pAT1a-shRNA2使之分别降低77%和56%,pAT1a-shRNA1使乳鼠心肌细胞（NRVMs）AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低70%和67%,pAT1a-shRNA2使之分别降低66%和52%,较对照质粒pCon组和空白对照Blank组有显著差异;对照质粒pCon组较空白对照Blank组AT1a受体表达无显著差异;各组AT2受体表达无显著差异。VSMCs单纯转染质粒各组A490nm无明显差异,给予AngII刺激后, pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组A490nm显著低于空白对照Blank组和对照质粒pCon组。3.动物体内实验:肾血管性高血压大鼠的尾动脉压（与干预前比较）:空白对照组（Blank）及对照质粒组（pCon）继续升高25mmHg左右, pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组下降15-16mmHg, Valsartan组下降约30mmHg;颈动脉压和左室/体重之比（组间比较）:pAT1a-shRNA1（194±5mmHg;2.27±0.37）、pAT1a-shRNA2（200±5mmHg;2.31±0.26 ）、缬沙坦组（ 164±5mmHg ; 2.26±0.39 ）显著低于Blank组（234±10mmHg;3.24±0.38）及pCon组（232±7mmHg;2.94±0.06）;Western-blot分析显示与Blank组相比,pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组左心室（分别下降53.3%和47.8%）和主动脉（分别下降58.7%和49.3%）组织内AT1受体表达显著减少。pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2及缬沙坦组心血管组织中胶原沉积亦明显减轻。同龄雄性健康SD大鼠, Normal pAT1a-shRNA1、Normal pAT1a-shRNA2组单次尾静脉注射RNA干扰质粒pAT1a-shRNA1和pAT1a-shRNA2后,尾动脉压较干预前无明显变化,颈动脉压与正常未干预空白对照（Normal blank）组无明显差异。结论RNA干扰技术能选择性下调原代培养的大鼠血管平滑肌细胞和乳鼠心肌细胞AT1a受体的表达,并显著抑制AngII促血管平滑肌细胞增殖的效应,无明显细胞毒性。体内实验表明RNA干扰AT1a受体有效地抑制了肾血管性高血压的进展及其心肌肥厚重构。RNA干扰技术可能成为高血压病基因治疗的一种新策略。
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