托吡酯对缺氧缺血性损伤新生大鼠脑保护作用的实验研究

论文摘要

背景新生儿围产期窒息导致的缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是新生儿期常见的临床疾病,是导致新生儿发病、死亡和远期神经系统发育障碍的重要因素,由于其发病机制复杂,迄今为止对其损伤后的治疗仍无根本性有力措施。因此,对HIBD发病机制及其治疗的进一步研究,是当今国内外尤为关注的围产医学热点。近年来,随着国内外对其发病机制的进一步研究,治疗上也相继出现了新途径。托吡酯（TPM）作为一种新型抗癫痫药,目前正广泛用于临床。随着对托吡酯研究的不断深入,其对窒息后脑损伤的保护作用已经得到证实。2006年Noh MR等人通过动物试验研究认为托吡酯脑保护作用机制主要有以下几点1.阻断电压依赖性Na2+或/和Ca2+通道2.激活GABA引发的Cl-内流3.阻滞KA/AMPA型谷氨酸受体的作用4.抑制碳酸酐酶的活性5.减轻线粒体损伤。国内少数的试验研究结果表明:托吡酯能减轻缺氧缺血后脑组织中钠蓄积,减轻脑水肿,减少神经元死亡,有效抑制氧自由基的产生及毒性,具有良好的防治脑损害的作用。但是关于托吡酯的给药时间、给药剂量、给药方式及其脑保护作用的具体机制等目前仍不明确,研究较少。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是TGF-β超家族的一个新亚族成员,目前已在多种神经细胞和神经相关细胞的培养中发现其表达。作为神经营养因子家族的新成员,GDNF发挥着多效能的神经营养作用。越来越多的证据表明,其在改善和促进损伤后的神经元修复和再生中发挥着重要作用。就新生儿HIBD治疗的特异性神经保护措施方面,神经营养因子是一个重要部分,对其的研究正日益受到广泛瞩目。在对体外培养的用兴奋性氨基酸建立的小脑皮质神经元变性损害模型实验中,培养液中的GDNF可明显减轻谷氨酸毒性,保护未受损细胞,促使受损细胞功能恢复,使细胞死亡率降低,从而减轻小脑皮质神经元变性死亡,并呈正量效关系。GDNF在不同时期表达不一,另外,脑损伤后GDNF表达变化也存在一定的时序性规律。出生后7d的大鼠脑与新生儿脑发育相似,造成一过性脑缺氧缺血的条件也与HIBD类似。国内外广泛采用新生7日龄大鼠建立HIBD模型来进行关于HIBD的研究。本实验研究亦采用此试验方法。以上问题构成本课题的设计思路和研究目的。通过建立缺氧缺血性损伤动物模型,借助观察脑损伤后不同时间托吡酯给药对脑组织病理学改变、GDNF动态表达水平等方面的影响,与对照组比较,进一步探讨托吡酯在脑保护作用中的治疗时间窗及调控机制。对上述问题进行深入研究,不仅有助于进一步阐明托吡酯脑保护作用的治疗机制,同时对托吡酯的治疗时间窗也得到一定程度探讨,为托吡酯治疗围产期HIBD的时机及作用机制提供强有力的理论和实验依据。目的1.观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后胶质细胞源性神经营养因子表达水平的动态变化。2.观察托吡酯不同时间给药对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠GDNF动态表达的影响。3.观察托吡酯对缺氧缺血性损伤新生大鼠脑保护作用的治疗时间窗。4.进一步探讨托吡酯脑保护作用的机制。方法1.152只新生7日龄大鼠随机分为假手术组、单纯缺氧缺血组、托吡酯治疗组,后者根据损伤后托吡酯不同时间给药又分成预处理组,后处理组及延迟治疗组。2.建立HIBD动物模型。3.给药及处理方法（1）托吡酯治疗组:将托吡酯溶于注射用水中,配成2%溶液,首剂给药剂量按150mg/kg经灌胃器由口注入,以迅速达到血液峰浓度,以后每次给药剂量均按100mg/kg;其中预处理组给药时间为缺氧缺血前立即、缺氧缺血后立即、之后每隔12h各一次,直至第五天;后处理组缺氧缺血前不给药,余同预处理组;延迟治疗组缺氧缺血后2h一次,之后每隔12h一次至第五天,各组总给药次数相同,均为12次,以观察托吡酯的治疗时间窗。（2）单纯缺氧缺血组和假手术组同时间点给予等体积的生理盐水。（3）各组均在在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分别处死1/4的动物（即假手术组每次处死6只,单纯缺氧缺血组和托吡酯各治疗组每次各8只）。4.应用HE染色、免疫组织化学及Western blotting等试验方法观察和测定研究指标。结果1.形态学结果单纯缺氧缺血组同侧脑组织梗塞液化发生率约90%,病理学改变包括纹状体、海马、皮层及下丘脑等部位出现组织脱失,组织苍白、萎缩,在严重损伤脑区域,大部分同侧半球发生液化,仅有很少的解剖标志可辨认;延迟处理组脑组织坏死也较明显;而预处理组及后处理组,脑损伤发生显著减轻。2.HE染色结果假手术组组织结构层次明晰,细胞轮廓清楚,核居中,尼氏体位于核周边:单纯缺氧缺血组在缺氧缺血后12h缺血侧皮质、纹状体出现轻微的病理变化,第2d病变最严重,表现为皮质、纹状体、海马、丘脑大片坏死区,第3d病变减轻,出现胶质细胞增生,第5d基本上未见到破裂细胞,出现大片胶质瘢痕;托吡酯预处理和后处理组术后12h上述部位病变不明显,第2d出现轻微病变,表现为极少数细胞间隙增宽,细胞核浓缩,第3d、5d未见明显病灶;托吡酯延迟处理组脑损伤减轻不明显。3.免疫组织化学假手术组仅见较少的GDNF阳性细胞表达,稀疏地分布于整个大脑皮质、纹状体、海马,双侧对称,各时间点上检测未见明显的动态变化;单纯缺氧缺血组和托吡酯各治疗组非缺血侧GDNF阳性细胞染色的程度、数量及变化情况均类似于假手术组;单纯缺氧缺血组缺血侧皮质GDNF阳性细胞在损伤后12h开始表达,第2d进一步上升,第3d达高峰,第5d基本恢复正常,仅见极少量的GDNF表达;托吡酯预处理组和后处理组缺血侧皮质在损伤后12h即可见较多GDNF阳性细胞的表达,第2d进一步增加,第三天达高峰,第5d有所减少,但还可见较多的表达,在每个时间点上均明显高于单纯缺氧缺血组（P＜0.05）,染色较深;延迟处理组GDNF阳性细胞的表达与单纯缺氧缺血组相比增加不明显,无统计学意义（P＞0.05）。4.Western blotting单纯缺氧缺血组与托吡酯各处理组均有GDNF蛋白表达条带,托吡酯预处理组和后处理组蛋白表达明显高于单纯缺氧缺血组,应用生物凝胶电泳图像分析系统（AlphaImager 2200）扫描定量,通过计算出各组蛋白表达的相对积分值作为蛋白的相对含量,经过统计学处理发现:托吡酯预处理组和后处理组各时间点上蛋白表达均高于单纯缺氧缺血组,有统计学意义（P＜0.05）;且预处理组蛋白表达又高于后处理组,有统计学意义（P＜0.05）:而延迟处理组蛋白表达与单纯缺氧缺血组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）结论1.托吡酯可以明显减轻缺氧缺血导致的脑细胞水肿、液化、坏死,降低脑损伤发生率,发挥较好的脑保护作用。2.缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达变化存在一定的时序性规律,于损伤后第三天达最高水平,托吡酯治疗可使缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达升高。3.托吡酯脑保护作用机制之一可能通过增加胶质细胞分泌GDNF实现。4.托吡酯的治疗时间窗较短,为缺氧缺血后2h之内,且预防性用药（损伤前给药）对HIBD神经元的保护作用强于紧急用药（损伤后给药）。

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