论文摘要
目的：急性白血病是儿童时期发病率最高的恶性肿瘤,我国每年至少有15000个新发病例。其中急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）约占70%,急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）约占25%。在儿童和青年的恶性肿瘤中白血病死亡率居首位。近年来联合化疗明显改善了儿童ALL的预后,但仍有20%-30%的高危患儿缺乏有效干预手段,而AML治疗效果更逊色于ALL。治疗失败的原因,主要是常规化疗选择性差,毒副作用大,还有白血病细胞的化疗耐药及复发等问题。因此,有必要寻找选择性高,毒副作用小的治疗方法来进一步提高白血病患儿生存率和生存质量,而靶向治疗可能是解决这一问题的重要途径和目前的研究热点。Rituximab（人鼠嵌合型抗人CD20单抗,美罗华）是靶向治疗成功的典范,实验研究和临床应用证明该单抗在CD20+B细胞恶性淋巴瘤治疗中具有良好疗效。CD45是位于细胞表面的白细胞共同抗原（leukocyte common antigen, LCA）,稳定并高水平地表达在除红系细胞、巨核细胞系/血小板、正常的原始造血干细胞之外的所有造血细胞表面,并且在85%～90%的白血病细胞表面也表达,而在机体其它非造血器官组织细胞不表达,这种差异表达使其具有了良好的靶向性。抗CD45单抗的研制为白血病的靶向治疗提供了新的手段。CD45编码基因外显子4、5、6或称A、B、C的可选择性剪接产生了多种变异体,在人体细胞上,CD45RO、CD45RB、CD45RAB、CD45RBC、CD45RABC这5种变异体已在蛋白水平被检测到,相对分子质量范围在180-220 kDa,CD45RAB和CD45RABC统称为CD45RA.本实验室自行研制的具有自主知识产权的杂交瘤细胞系分泌的鼠抗人单克隆抗体ZCH-6-3A4（简称3A4）已经通过国际鉴定为抗人CD45亚类抗体,属鼠IgG1κ,2000年被第7届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（简称HLDA7）正式命名为CD45RA。本实验室研究表明,3A4单抗不能阻滞CD45抗体（克隆名2D1,IgG1,识别180～220 kDa所有人CD45蛋白亚型）与KGla细胞的反应,这表明3A4单抗与CD45抗体识别的表位不同。3A4单抗也不能阻滞CD45RO抗体（克隆名UCHL-1,识别180kDa的人CD45蛋白亚型CD45RO）与CD45RO阳性的T细胞反应,这表明3A4单抗不能识别CD45RO。3A4单抗能够阻滞CD45RA单抗（克隆名L48,识别220kDa的人CD45蛋白亚型CD45RABC）与KG1 a细胞的反应。一般来说,3A4既然能够阻滞另一个标准CD45RA抗体与KGla细胞的反应,那么它应该识别与之相同的抗原表位,并且应该具有类似的细胞反应谱。但我们进一步研究发现3A4单抗与白血病细胞的反应谱与CD45RA （L48）尚存在比较明显的差别。因此,有必要澄清3A4单抗所识别抗原表位,为此单抗的进一步深入研究及其应用奠定基础。方法：（1）制备3A4 FITC直标抗体。将3A4杂交瘤细胞系注入Balb/c小鼠腹腔内制备含3A4抗体的腹水,采用SPA Sepharose亲和层析法从腹水中纯化3A4抗体蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定抗体纯度及分子量,采用改良Marshall法制备异硫氰酸荧光素标记的3A4抗体（3A4 FITC）,并通过流式细胞术（flwo cytometry. FCM）鉴定。（2）建立3A4识别的抗原表达谱。由于CD45编码序列的外显子4、5、6的可选择性剪接而产生各种蛋白亚型,因此设计引物扩增CD45序列的外显子2至外显子8的部分序列（我们命名为CD45-1）,PCR检测各种细胞在基因水平的CD45亚型分布情况。通过流式细胞术检测3A4识别的抗原在人正常外周血、PHA活化的外周血T淋巴细胞、白血病细胞以及细胞系上的分布。并通过Weste Blot检测白血病细胞系上3A4抗原的分布。（3）真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RBC的构建。根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）上检索到的CD45基因序列（NM 002838）设计引物扩增自起始密码子至终止密码子的CD45基因序列全长。由于外显子4、5、6的可选择性剪接导致有多个变异体同时存在,导致无法用单次PCR得到单个变异体,故把CD45基因人为的分割成4个部分（我们命名为CD45-1.CD45-2、CD45-3和CD45-4）,CD45-1与CD45-2、CD45-2与CD45-3、CD45-3与CD45-4均有一小段重叠序列。设计4对引物分别扩增CD45-1（2-8号外显子）、CD45-2（8-15号外显子,1038bp）、CD45-3（15-24号外显子,963bp）和CD45-4（24-33号外显子,1343bp）,其中CD45-1序列上游引物5’端引入HindⅢ酶切位点,CD45-4序列下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点。然后采用重叠延伸拚接PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）将CD45-1、CD45-2、CD45-3和CD45-4这4个片段在基因水平上拚接扩增,克隆得到CD45基因全长的cDNA。并通过TA克隆系统将其克隆到pCR（?）-2.1载体中,经测序鉴定,我们首先成功克隆得到的是序列完全匹配的pCR（?）-2.1/CD45RBC的TA克隆。因此我们首先构建CD45RBC的真核表达载体。将pCR（?）-2.1/CD45RBC和真核表达载体pcDNA3.1+用HindⅢ和XhoⅠ双酶切后连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,挑取克隆摇菌扩增后抽提质粒DNA经酶切及测序鉴定为目的基因,至此得到真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RBC. （4）真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC的构建.CD45-1片段包括外显子2至外显子8的部分序列（外显子4、5、6为可选择性剪接序列）,因此而产生的变异体我们分别命名为CD45RO-1、CD45RA-1、CD45RB-1、CD45RC-1、CD45RBC-1、CD45RAB-1和CD45RABC-1,分别构建相应的TA克隆。各亚型均有一段99bp的共同序列（包括7号外显子和8号外显子部分碱基）,其中有Afe I的酶切位点。将TA克隆pCR（?）-2.1/CD45RA-1、pCR（?）-2.1/CD45RAB-1、pCR（?）-2.1/CD45RABC-1和pcDNA3.1+/CD45RBC分别用HindⅢ和AfeⅠ双酶切后连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,挑取克隆摇菌扩增后抽提质粒DNA经酶切及测序鉴定为目的基因,至此分别得到真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC。（5）CD45抗原亚型在真核细胞膜上的表达及3A4抗体识别抗原的鉴定。将空载体pcDNA3.1+以及构建成功的真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC分别摇菌扩增,转染级抽提试剂盒抽提质粒,紫外分光光度计和电泳测质粒DNA浓度和纯度。然后采用LipofectamineTM 2000试剂盒通过脂质体转染的方法将空载体pcDNA3.1+和上述4个CD45基因亚型真核表达载体分别转染入真核细胞CHO,通过G418筛选并通过多次亚克隆建立稳定转染细胞系。抽提转染后细胞总RNA,通过RT-PCR检测转染后细胞内基因的表达情况。采用流式细胞术检测转染后细胞膜上的CD45蛋白表达情况。通过流式细胞术及Western blot等方法鉴定3A4抗体所识别的抗原亚型。（6）CD45断裂基因（CD45-B17）真核表达载体的构建。由于CD45基因亚型真核表达载体较大,转染后CHO稳定转染建系较困难。为了提高转染效率,建立稳定转染CD45基因的细胞系,并进一步鉴定3A4抗体识别的抗原表位,我们又构建了5个CD45断裂基因真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。CD45基因的16号外显子序列是编码跨膜区的,在17号外显子中插入一个终止密码子TAG,构建从CD45的起始密码子至17号外显子（包括跨膜区编码序列）的真核表达载体,使CD45蛋白翻译提前终止,形成只包括胞外区和跨膜区的断裂蛋白。CD45基因序列仅在10号外显子中存在一个BsrG I的酶切位点,我们利用PCR在17号外显子中引入一个终止密码子TAG和XhoI酶切位点,构建自BsrG I酶切位点至Xho I酶切位点的TA克隆（pCR（?）-2.1/B17）,然后将pCR（?）-2.1/B17和pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC pcDNA3.1+/CD45RAB、pcDNA3.1+/CD45RABC利用BsrG I和XhoI双酶切后连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,挑取克隆摇菌扩增后抽提质粒DNA经酶切及测序鉴定为目的基因,至此分别得到真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。将pCR（?）-2.1/CD45RC-1和pcDNA3.1+/CD45RBC-B17用HindⅢ和Afe I双酶切后连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,挑取克隆摇菌扩增后抽提质粒DNA经酶切及测序鉴定为目的基因,至此得到真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RC-B17。（7）CD45断裂蛋白亚型在真核细胞膜上的表达及3A4抗体识别抗原的进一步鉴定。将空载体pcDNA3.1+以及构建成功的真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDN A3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17分别摇菌扩增,转染级抽提试剂盒抽提质粒,紫外分光光度计和电泳测质粒DNA浓度和纯度。然后采用LipofectamineTM2000试剂盒通过脂质体转染的方法将空载体pcDNA3.1+和上述5个CD45断裂基因亚型真核表达载体分别转染入真核细胞CHO,通过G418筛选并通过多次亚克隆建立稳定转染细胞系。抽提转染后细胞总RNA,通过RT-PCR检测转染后细胞内基因的表达情况。采用流式细胞术检测转染后细胞膜上的CD45断裂蛋白表达情况。通过流式细胞术及Western blot等方法鉴定3A4抗体所识别的抗原亚型。结果：（1）经过SDS-PAGE鉴定,3A4重链和轻链分子量分别为58kDa和30kDa。流式细胞术检测结果显示,制备的3A4 FITC直标抗体与KGla细胞阳性反应率超过98%,表达峰型狭窄。（2）3A4识别的抗原在人正常外周血的T细胞、B细胞和NK细胞表面高表达（78.16±8.77%、99.31±1.01%、88.58±10.81%）,单核细胞表面部分表达（39.39±12.28%）,而中性粒细胞表面不表达（2.07±0.35%）。对PHA活化的外周血T淋巴细胞进行流式细胞术分析发现,随着活化时间的延长,3A4识别的抗原表达减少。对30例（B系ALL 14例,T系ALL 5例,AML 11例）初诊白血病患者骨髓中的白血病细胞进行流式细胞术分析后发现,进口CD45RA的阳性率低于3A4。（3）流式细胞术检测发现3A4识别的抗原在KGla、Raji和U937细胞上均为高表达,Molt-3细胞上低表达,而Nalm-6、K562和HL60细胞不表达。分别以细胞系U937、KGla、Raji Molt-3 Nalm-6 K562和HL60 cDNA为模板,以CD45-1上下游引物扩增CD45序列的外显子2至外显子8的部分序列（CD45-1）。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳、切胶纯化、TA克隆并经测序鉴定结果表明,这7种细胞系均有多个CD45-1基因亚型。U937和KGla表达CD45RABC-1和CD45RBC-1, Raji表达CD45RABC-1CD45RBC-1和CD45RB-1（微量）,Nalm-6表达微量的CD45RABC-1、CD45RBC-1、CD45RB-1和CD45RO-1, Molt-3表达CD45RAB-1, CD45RBC-1、CD45RB-1、和CD45RO-1, K562和HL60 （微量）表达CD45RB-1和CD45RO-1。Western Blot结果表明,3A4抗体识别的抗原大小为200kDa左右,Raji和KGla细胞裂解液中均有丰富的3A4抗体识别的抗原,而K562和Nalm-6细胞裂解液中未检测到3A4抗体识别的抗原。（4）真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RBC、pcDNA3.1+/CD45RAB和pcDNA3.1+/CD45RABC扩增提取质粒DNA后经酶切及测序鉴定分别包含相应的目的基因片段CD45RA（3714bp）. CD45RBC（3801bp）、CD45RAB （3855bp）和CD45RABC （3999bp）,表明该4个CD45基因真核表达载体已构建成功。（5）构建成功的4个CD45基因真核表达载体和空载体分别转染真核细胞CHO,然后按照测定的CHO细胞对G418的死亡曲线,以600μg/ml的G418筛选浓度进行持续加压筛选。转染后细胞分别命名为CD45RA-CHO、CD45RBC-CHO、CD45RAB-CHO和CD45RABC-CHO。2-3周后进行目的基因及蛋白表达检测。RT-PCR结果显示转染后的各亚型CD45-CHO细胞中CD45-1基因大小均与理论序列相符合,表明目的基因在基因水平有表达。通过流式细胞术在蛋白水平检测到CD45抗原在CD45-CHO细胞膜上成功表达。（6）流式细胞术结果显示3A4能够识别CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO细胞上的抗原。Western Blot显示3A4识别CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO细胞裂解液中200kDa左右的蛋白质,而CD45RA-CHO和CD45RAB-CHO细胞上未检测到3A4抗体识别的抗原。（7）由于CD45基因亚型真核表达载体较大（近10000bp）,转染后CHO稳定转染建系较困难。传代第5～6次以后阳性细胞数便低于10%。尚未能建立稳定转染细胞系。为了提高转染效率,建立稳定转染CD45基因的细胞系,并进一步鉴定3A4抗体识别的抗原表位,我们又构建了5个CD45断裂基因真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RBC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17和pcDNA3.1+/CD45RABC-B17。这5个表达载体扩增提取质粒DNA后经酶切及测序鉴定分别包含相应的目的基因片段CD45RA-B17 （1583bp）、CD45RC-B17 （1529bp）、CD45RBC-B17 （1670bp）、CD45RAB-B17 （1724bp）和CD45RABC-B17 （1868bp）,表明这5个CD45断裂基因真核表达载体已构建成功。（8）构建成功的5个CD45断裂基因真核表达载体和空载体分别转染真核细胞CHO,然后以600μg/ml的G418筛选浓度进行持续加压筛选。转染后细胞分别命名为CD45RA-B17-CHO、CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO、CD45RAB-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO。2-3周后进行目的基因及蛋白表达检测。RT-PCR结果显示转染后的各亚型CD45-B17-CHO细胞中CD45断裂基因大小均与理论序列相符合,表明目的基因在基因水平有表达。通过流式细胞术在蛋白水平检测到CD45断裂蛋白在CD45-B17-CHO细胞膜上成功表达。（9）流式细胞术和细胞免疫荧光显示3A4能够识别CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO细胞上的抗原。Western Blot结果3A4识别CD45RC-B17-CHO、CD45RBC-B17-CHO和CD45RABC-B17-CHO细胞裂解液中70kDa左右的蛋白质,而CD45RA-B17-CHO和CD45RAB-B17-CHO细胞上未检测到3A4抗体识别的抗原。（10）通过G418筛选建立稳定转染细胞系,其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO建系成功。结论：（1）3A4识别的抗原主要分布在T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞膜,而中性粒细胞膜上不表达。（2）成功构建pcDNA3.1+/CD45RA、pcDNA3.1+/CD45RAB、pcDNA3.1+/CD45RBC和pcDNA3.1+/CD45RABC及pcDNA3.1+/CD45RA-B17、pcDNA3.1+/CD45RC-B17、pcDNA3.1+/CD45RAB-B17 pcDNA3.1+/CD45RBC-B17和pcDN A3.1+/CD45RABC-B17真核表达载体。在基因水平和蛋白水平检测到转染CHO细胞成功,CD45均能在CHO细胞膜上成功表达。其中CD45RBC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO获得稳定转染细胞系。（3）3A4能够识别转染CD45基因的细胞CD45RBC-CHO和CD45RABC-CHO以及转染CD45断裂基因的细胞CD45RBC-B17-CHO、CD45RABC-B17-CHO和CD45RC-B17-CHO。（4）本研究表明3A4能够识别人的五种CD45亚型中的CD45RBC和CD45RABC,识别的抗原表位为CD45的C外显子。
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