论文摘要
牙齿是由口腔上皮和神经嵴来源的外胚间充质相互作用而形成的。人类牙齿的发育,经历蕾状期、帽状期、钟状期、牙根发育和牙齿萌出期。人类的牙齿和啮齿类动物的磨牙在牙冠发育完成以后,成釉器内釉、外釉上皮细胞在颈环处增生,形成两层上皮结构,即Hertwig’s上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath,HERS）,标志着牙根发育的启动。而啮齿类动物（如大鼠、小鼠）的切牙终生不发育形成典型牙根结构,且终生不断萌出。研究认为,在切牙的末端存在apical bud结构,其中有成体干细胞,后者不断缓慢分裂增生,分化为成釉细胞,形成釉质,使得切牙不断生长。那么HERS和apical bud这两种来源于成釉器的牙上皮细胞究竟有着怎样的生物学性质,它们之间又有怎样的差异而导致形成两种完全不同的发育模式呢?本课题的目的是研究这两种上皮细胞的生物学性质,寻找其间的差异,为牙根发育机制的研究提供实验依据。本课题采用组织学、免疫组织化学、细胞培养、RT-PCR、蛋白质组学和体内种植等技术方法进行了以下四部分实验研究,主要研究内容和结果如下:第一部分apical bud和HERS组织学研究实验一:采用组织学方法观察了出生后（postnatal, PN）0-10d SD大鼠切牙apical bud和磨牙HERS的组织学结构,结果发现:apical bud位于切牙胚唇侧末端,PN0d即已形成,为三层细胞构成的上皮结构,含有内、外釉上皮,及其间的星网层细胞,星网层细胞含量非常丰富,使得apical bud成为球形结构深入末端牙乳头组织中。HERS在PN 7d SD大鼠磨牙胚颈部形成,为内、外釉上皮两层细胞构成,星网层细胞消失,而呈连续的扁平状结构。实验二:采用免疫组织化学方法观察了FGF10, Notch1, BMPs在apical bud和HERS组织中的表达。结果发现:FGF10在apical bud周围牙乳头细胞中表达,而HERS内侧牙乳头细胞表达阴性;Notch1表达于apical bud中;BMPs在HERS中表达。表明虽然有着共同的发育起源,但是一些特异的调控因子表达存在差异。提示牙根发育启动存在特异性的调控机制。实验三:采用透射电镜方法,观察apical bud和HERS超微结构。结果:apical bud中部分细胞胞膜增厚,形成桥粒样细胞连接,部分细胞中间丝丰富,并呈类似黏液上皮样细胞形态。HERS两层上皮细胞整齐排列,内层为柱状或立方状细胞,细胞之间胞膜相嵌、融合,形成紧密连接。第二部分apical bud和HERS细胞生物学性质研究实验一:通过机械分离切牙胚颈部唇侧末端和磨牙胚颈部组织,酶消化法原代混合培养,10%FBS DMEM/F12培养液连续培养,差别胰酶消化法进行细胞纯化的方法,分别培养apical bud和HERS细胞。结果发现:在10%FBS DMEM/F12培养液中原代细胞生长状态良好,增殖迅速,经3次差别消化得到纯化的上皮细胞。免疫细胞化学实验证实得到的细胞为上皮细胞。实验二:通过MTT检测、流式细胞术、免疫细胞化学、茜素红染色和RT-PCR等方法对apical bud和HERS细胞一些生物学性质进行了初步研究。结果发现:apical bud细胞表达Amelogenin, Ameloblastin, Notch1,而HERS细胞表达BMP2,4。体外培养的apical bud细胞有矿化形成能力。第三部分apical bud和HERS细胞差异蛋白质组学研究实验一:通过双向凝胶电泳实验对apical bud和HERS细胞蛋白表达谱进行研究和对比。结果发现:apical bud和HERS细胞差异表达蛋白有145个,相对于apical bud细胞,HERS细胞表达的蛋白新增36点,缺失23点,有68点表达上调,有18点下调。实验二:通过肽质量指纹谱方法对实验一得到的差异蛋白进行研究,结果:鉴定出10个蛋白质,其功能涉及细胞的氧化还原反应、酶活性等方面。第四部分apical bud和HERS细胞与牙乳头细胞团体内种植实验研究利用体外培养的apical bud和HERS细胞分别与切牙和磨牙胚牙乳头细胞重组后,细胞团种植于大鼠肾被膜下。结果发现:apical bud和切牙牙乳头细胞团形成组织结构规则的釉质和牙本质组织,HERS细胞与磨牙牙乳头细胞团形成了骨样牙本质样组织。表明apical bud和牙乳头细胞间可以相互诱导,分化出成釉细胞和成牙本质细胞,形成牙体组织,HERS细胞能够诱导牙乳头细胞分化为成牙本质细胞。