重组人巨细胞病毒嵌合肽的表达纯化及活性研究

论文摘要

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染在人群中非常普遍,主要是呈隐性或亚临床感染,近年来发现该病毒不只在新生儿、免疫抑制及免疫缺陷患者中导致广泛的临床症状和死亡,而且可能与人类三大疾病--心血管疾病,恶性肿瘤及糖尿病有关,因而建立HCMV的快速检测方法具有重要意义。多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体,选用抗原性强、特异性好的蛋白抗原代替全病毒以检测HCMV感染,是提高HCMV感染诊断的敏感性和特异性的有效途径。国外的研究证实,HCMV的gp52蛋白和pp150蛋白具有较强的抗原性,在HCMV感染者的血清中其相应的抗体检出率较高,本实验室已成功构建串连有编码gp52 C末端和编码pp150 C末端两个基因片段的pPIC9K-rHCMVp表达质粒,并在毕赤酵母获得成功表达。但该质粒缺少纯化标记,不利于分离纯化,本研究将该质粒中人巨细胞病毒嵌合肽（rHCMVp）基因片段导入带纯化标志his6的pPICZαA中,重新构建、筛选了表达人巨细胞病毒嵌合肽（rHCMVp）的基因工程酵母。根据其基因序列,设计引物从pPIC9K-rHCMVp上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母GS115细胞中,筛选获得表达量较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。2L发酵罐进行了高密度发酵,经1%的甲醇、pH6.0的条件下诱导48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白78.7mg,比摇瓶提高了4.8倍的产量。rHCMVp嵌合肽蛋白可通过高密度发酵大量获得。通过金属螯合亲和层析分离纯化发酵液上清,获得较高纯度的rHCMVp嵌合肽蛋白,进行了活性研究。实验结果证实该蛋白能被抗全病毒血清检测,且具有免疫原性;与市售进口的ELISA人巨细胞病毒检测试剂盒相比,两种方法的一致性较好,我们选择的gp52和pp150两个片段的嵌合肽蛋白作为包被抗原可用于HCMV感染的检测,为制备或组装高特异性和敏感性的HCMV基因工程抗原试剂盒提供依据。

论文目录

• 第一部分 前言
• 1.1 人巨细胞病毒的研究现状
• 1.2 人巨细胞病毒感染的诊断方法
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验仪器，材料和试剂
• 2.2 本研究的技术路线
• 2.3 实验方法
• 第三部分 实验结果
• 3.1 PCR法获得目的基因片段
• 3.2 重组质粒的构建和鉴定
• 3.3 重组质粒转化酵母和重组子的筛选
• 3.4 rHCMVp基因在酵母中的表达
• 3.5 rHCMVp高密度发酵条件的优化
• 3.6 工程菌株高密度发酵诱导培养
• 3.7 目的产物的纯化
• 3.8 目的蛋白活性实验
• 第四部分 讨论
• 4.1 表达载体的构建与鉴定
• 4.2 rHCMVp基因的电转化和酵母表达菌株的筛选
• 4.3 在巴斯德毕赤酵母中的表达条件的研究
• 4.4 巴斯德毕赤酵母高密度发酵
• 4.5 表达目的产物的纯化
• 4.6 目的蛋白生物活性研究
• 4.7 小结
• 第五部分 参考文献
• 附录一 各种试剂的配制方法
• 附录二 重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽的DNA测序结果
• 附录三 重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽的氨基酸序列
• 附录四 英文缩略词索引
• 附录五 在校期间发表研究论文情况
• 致谢