草鱼转录组及Ⅰ型微卫星的进化

论文摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella,Valenciennes, 1844)是世界上最重要的水产养殖品种之一,也是亚洲养殖最广泛的食用鱼类之一,由于草鱼高产量等养殖特性,致使它已经成为中国鱼类蛋白的最主要来源。而且,作为一种草食性的淡水养殖品种,草鱼不仅能在中国的水产业中起到重要作用,而且被广泛引进到欧美等地用于控制水草的生长。由于草鱼近亲繁殖导致的流行疾病的大量爆发(例如出血症),每年给草鱼养殖业带来了巨大的损失,此外,草鱼对北美当地鱼类种群产生了灾害性的影响,威胁到了当地本土的鱼类物种。因此掌握草鱼的遗传信息,对于物种的应用和水产养殖业的发展具有重要作用。迄今为止,在GenBank中草鱼EST序列信息仍然很少,因此本研究的主要目的就是构建草鱼EST文库,鉴定与EST相关的分子标记,例如微卫星、SNP位点以用于该物种的遗传分析。我们总共得到6269个非空载体克隆,得到4815个基因序列,其中鉴定得到105个含有微卫星的EST序列和5228个SNP位点。这些EST信息预期能够为基因功能的鉴定、遗传连锁图谱的绘制及数量性状基因座的分析提供依据。Ⅰ型微卫星指的是与已知功能基因相连锁的微卫星序列。目前在鱼类中已经有大量微卫星多态性研究的报道,但是对于基因中微卫星所行使的具体功能仍然知之甚少,因此我们将研究草鱼Ⅰ型微卫星的进化作为研究草鱼遗传信息的第二步具有至关重要的意义。通过对草鱼8个含有Ⅰ型微卫星的序列进行分析,发现其中的两个微卫星多态性基因MKLN1基因和RRP7A基因具有可变剪接现象。MKLN1编码的muskelin蛋白主要通过其羧基端的kelch重复结构域与其它蛋白形成复合物行使功能。通过分析草鱼鳃组织的基因转录谱,发现其中的MKLN1存在(CT)15的微卫星序列,通过检测3个不同的草鱼种群,又发现(CT)9、(CT)10、(CT)11和(CT)13四种多态性序列。通过克隆该段MKLN1基因组序列并与斑马鱼和红鳍东方鲀的MKLN1基因组序列比较,发现克隆得到的草鱼基因序列是由一个内含子和两个外显子组成,总共编码144个氨基酸。通过进一步调查不同组织该基因的转录本,发现存在内含子剪接和内含子没被剪接的两个转录本。由于内含子序列未被剪接的转录本在内含子中存在“TGA”终止密码子,导致MKLN1翻译提前终止,翻译产物为失去部分kelch结构域的muskelin蛋白。相对于内含子正常剪接的转录本,没有被剪接内含子的转录本在各种组织中的表达量要明显低得多。简而言之,本研究发现了草鱼MKLN1转录本中的微卫星序列是来自未被剪切的内含子,而未被剪切的内含子导致该转录本编码部分kelch结构域缺失的muskelin蛋白。RRP7A基因属于Rrp7家族成员,该基因编码的蛋白主要通过RRM结构域参与rRNA前体的加工过程,通过在草鱼肠道组织cDNA文库的表达序列标签中,发现RRP7A基因的编码区含有(AC)14重复的微卫星序列,通过微卫星多态性检测,发现草鱼三个不同种群中含有(AC)15和(AC)16多态性重复。通过克隆该草鱼RRP7A基因组序列,并与草鱼RRP7A基因的cDNA序列比较,发现该基因组序列是由6个内含子和7个外显子组成,总共编码276个氨基酸,微卫星序列位于内含子3中。通过进一步调查该基因在不同组织表达情况,发现存在6种可变剪接转录本,并且在转录本S2中含有(AC)19的微卫星序列,该转录本由于内含子的存在导致终止密码子提前,产生编码失去RRM结构域的蛋白,而转录本S3~S5都由于可变剪接导致跨膜结构域的丢失,因此转录本S2~S5可能失去蛋白的原有功能。通过对草鱼Ⅰ型微卫星多态性调查分析,发现这两种基因的微卫星序列均位于内含子中,并且微卫星多态性本身并不是造成蛋白质多样性的直接原因,而可变剪接的存在影响了相应蛋白的功能。同时,表明RNA可变剪接是造成ESTs序列中含微卫星序列的一种途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 鱼类转录组研究现状
• 1.1.1 转录组的定义
• 1.1.2 鱼类转录组研究现状
• 1.1.3 草鱼转录组研究现状
• 1.2 微卫星多态性研究现状
• 1.3 可变剪接的研究现状
• 1.3.1 调控可变剪接的RNA 原件及相关因子
• 1.3.2 内含子的进化
• 1.4 研究草鱼转录组及微卫星进化的意义
• 第二章 草鱼EST 文库构建及序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 EST 序列分析
• 2.1.3 微卫星序列分析和SNP 位点分析
• 2.1.4 基因功能分类
• 2.2 结果
• 2.2.1 EST 序列分析
• 2.2.2 EST 比对结果
• 2.2.3 草鱼与鲤鱼EST 序列比较分析结果
• 2.2.4 Gene ontology（GO）注释
• 2.2.5 分子标记的鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 草鱼MKLN1 基因可变剪接和微卫星序列的多态性
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 样品来源
• 3.1.2 基因组DNA 提取
• 3.1.3 微卫星多态性的检测及序列测定
• 3.1.4 MKLN1 基因组部分序列的克隆和分析
• 3.1.5 RT-PCR 及可变剪接转录本的克隆
• 3.2 结果
• 3.2.1 MKLN1 cDNA 序列及其所包含的微卫星多态性
• 3.2.2 微卫星序列位于MKLN1 第10 内含子区域
• 3.2.3 MKLN1 的可变剪接及其组织特异性
• 3.3 讨论
• 第四章 草鱼RRP7A 基因的可变剪接及其基因组进化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 样品来源
• 4.1.2 基因组DNA 提取
• 4.1.3 微卫星多态性的检测及序列测定
• 4.1.4 RRP7A 基因组序列的克隆和分析
• 4.1.5 RT-PCR 及可变剪接转录本的克隆
• 4.1.6 cDNA 序列分析和蛋白质预测分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 RRP7A cDNA 序列及其所包含的微卫星多态性
• 4.2.2 RRP7A 基因的基因结构分析
• 4.2.3 RRP7A 基因可变剪接分析
• 4.2.4 RRP7A 各转录本蛋白质功能及功能结构域预测
• 4.2.5 RRP7A 基因可变剪接的组织表达情况
• 4.2.6 RRP7A 基因系统进化分析
• 4.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 已接受或发表的论文
• 致谢