复合功能基因投递系统的构建和体内外研究

论文摘要

细菌磁小体（BMPs）是趋磁性细菌体内依靠生物矿化法合成的磁性纳米颗粒,主要由磁核和包被磁核的脂质膜两部分组成。磁小体本身所具有的独特性质,使其在许多领域得到了广泛的应用,但作为基因载体的应用研究还很少。本文通过对磁小体的修饰和改性,将其构建成具有磁靶向和跨膜复合功能的基因投递系统,并在此基础上使用该基因投递系统对人脑胶质瘤进行体内外基因治疗实验,并探讨治疗效果。本文通过FTIR、XPS、TEM和HRTEM对磁小体脂质膜的组分、官能团和微观形貌进行观察和分析,发现磁小体具有独特的微观排列形貌和粒径分布,平均粒径为45nm,饱和磁化强度为74.33emu/g,并采用荧光胺的方法对磁小体脂质膜上氨基含量进行了定量分析,发现每毫克磁小体的脂质膜上含有58.58 nmol的氨基基团;通过XRD、SQUID和紫外-可见分光光度计对磁小体磁核的组分和磁性能进行分析,发现磁小体的磁核由四氧化三铁晶体组成,具有较强的磁响应性和分散稳定性,并通过ICP-MS分析了磁小体中铁元素的含量为每毫克磁小体含有0.605mg的铁元素,含有约3.3549×1012个磁小体颗粒;细胞毒性实验的结果证实了磁小体具有很好的生物相容性。通过碳二亚胺（EDC·HCl）偶合法,制备出具有磁靶向的基因投递系统（BMPs-PAMAM）,并优化了制备条件,在此基础上将跨膜多肽（Tat）借助偶联剂（Sulfo-LC-SPDP）连接到BMPs-PAMAM磁性粒子表面,制备出具有磁靶向和跨膜复合功能的基因投递系统（Tat-BMPs-PAMAM）。通过FTIR、XPS、Zeta Potential Analyzer、TEM、SQUID和紫外-可见分光光度计对复合功能基因投递系统的结构、组成、微观形貌和磁性能进行了分析表征。定量了每毫克BMPs表面接枝有0.056mg的PAMAM大分子和0.027mg的Tat多肽,大约每个BMPs上接枝了1472个PAMAM大分子和3190个Tat多肽分子。该投递系统粒径均匀,约为50nm;具有较强的磁响应性和分散稳定性,其饱和磁化强度为62.46emu/g。凝胶电泳阻滞实验证明了两种基因投递系统（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs- PAMAM）均能够与报告质粒（pEGFP与pGL-3）形成非常稳定的复合物,并且对报告质粒具有很好的酶切保护作用;细胞毒性实验证实了两种投递系统具有较好的生物相容性。使用两种基因投递系统将两种报告质粒转染U251细胞,结果显示,当BMPs-PAMAM与报告质粒的质量比为20:1、Tat-BMPs-PAMAM与报告质粒的质量比为12.5:1时,均具有最高的转染效率,分别为16.65%和20.56%,并且外加磁场的靶向性作用能够使两种基因投递系统的转染效率提高25%。体外磁靶向跨膜定位实验证明所制备的两种复合功能基因投递系统（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs- PAMAM）具有较好的磁靶向和跨膜复合功能,其转染效率分别为为11.56%,13.28%,高于商用转染试剂Lipofectamine 2000的转染效率9.86%。对两种基因投递系统进行放射性元素99mTc标记,用SPECT考察了两种投递系统荷载pGL-3质粒的复合物在正常SD大鼠体内分布情况,并详细考察了注射方式、Tat多肽和外加磁场对复合物在各脏器中分布和跨血脑屏障能力的影响,显示其磁靶向和跨膜的复合功能。使用U251胶质瘤细胞模型研究了两种基因投递系统的体外基因转染对肿瘤的抑制效果,并与Lipofectamine 2000进行了对比。通过细胞免疫荧光、细胞免疫组化和Western blot检测相关靶蛋白的表达,证明了Tat-BMPs-PAMAM与Lipofectamine 2000对靶蛋白具有相似的治疗效果。体外细胞生物学特性实验证明,经两种基因投递系统基因治疗后的U251细胞的增殖活性和侵袭能力均显著降低,凋亡细胞数显著上升,并且Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM /psiRNA具有更好的体外抑制效果,与Lipofectamine 2000/psiRNA组相比没有显著性的差异。以荷U251胶质瘤裸鼠为动物模型研究了两种基因投递系统的体内基因转染对肿瘤的抑制效果。裸鼠体内肿瘤生长速率曲线、肿瘤组织标本的免疫组化和原位凋亡检测（TUNEL法）的结果与体外实验结果相一致:经体内基因治疗后,Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM/psiRNA具有更好的体内治疗效果,与Lipofectamine 2000/psiRNA组相比没有显著性的差异。综上所述,本文将纳米生物技术与肿瘤分子生物学技术相结合,将制备的BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM作为非病毒基因投递系统进行基因治疗的研究,充分利用磁小体的磁靶向性和Tat多肽的跨膜功能构建出具有复合功能的非病毒基因投递系统,为疾病的基因治疗尤其是中枢神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 脑胶质瘤
• 1.2.1 脑胶质瘤与基因治疗
• 1.2.2 RNAi 技术
• 1.2.3 EGFR-P13K-AKT 信号通路
• 1.3 基因载体
• 1.3.1 病毒性基因载体
• 1.3.2 非病毒类基因载体
• 1.3.3 聚阳离子基因载体介导的基因转染的一般过程
• 1.3.4 Starburst PAMAM dendrimers 树枝状聚合物基因载体
• 1.4 具有跨膜和磁靶向复合功能的基因投递系统的构建
• 1.4.1 趋磁性细菌与磁小体
• 1.4.2 跨膜多肽TAT 概述
• 1.5 本文的研究内容及意义
• 第二章 磁小体理化性质的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂与仪器
• 2.2.2 磁小体的纯化
• 2.2.3 磁小体理化性质的研究
• 2.2.4 磁小体细胞毒性的研究
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 磁小体的清洗提纯
• 2.3.2 磁小体脂质膜理化性质的研究
• 2.3.3 磁小体磁核理化性质的研究
• 2.3.4 磁小体理化性质的研究
• 2.3.5 磁小体细胞毒性的研究
• 2.4 本章小结
• 第三章 具有复合功能基因投递系统的构建与表征
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验试剂与仪器
• 3.2.2 BMPs-PAMAM 基因投递系统的构建
• 3.2.3 Tat-BMPs-PAMAM 复合功能基因投递系统的构建
• 3.2.4 具有复合功能基因投递系统的表征
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 构建BMPs-PAMAM 基因投递系统反应条件的优化
• 3.3.2 具有复合功能基因投递系统的表征
• 3.4 本章小结
• 第四章 复合功能基因投递系统体外报告基因转染效率的评价
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验试剂与仪器
• 4.2.2 报告质粒的提取
• 4.2.3 凝胶阻滞实验
• 4.2.4 复合物稳定性实验
• 4.2.5 Dnase I 酶切保护实验
• 4.2.6 基因载体细胞毒性实验
• 4.2.7 报告质粒的转染实验
• 4.2.8 体外磁靶向跨膜定位实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 报告质粒的提取与鉴定
• 4.3.2 DNA 结合实验
• 4.3.3 聚合物稳定性实验
• 4.3.4 DNA 酶切保护实验
• 4.3.5 载体的细胞毒性实验
• 4.3.6 体外转染实验
• 4.3.7 体外磁靶向跨膜定位实验结果
• 4.4 本章小结
• 第五章 复合功能基因投递系统体内分布和跨血脑屏障功能研究-
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验试剂与仪器表
• 5.2.2 磁性复合功能载体的放射性标记[188]
• 5.2.3 磁性复合功能载体载基因体内分布
• 5.3 结果与讨论
• 99mTc 跨血脑屏障（BBB）功能检测'>5.3.1 放射性元素^99mTc 跨血脑屏障（BBB）功能检测
• 99mTc-复合功能基因投递系统的体内分布和跨BBB 功能检测-'>5.3.2^99mTc-复合功能基因投递系统的体内分布和跨BBB 功能检测-
• 5.4 本章小结
• 第六章 载psiRNA 复合功能基因投递系统抑制 U251 人脑恶性胶质瘤的细胞实验研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验试剂与仪器
• 6.2.2 细胞培养
• 6.2.3 治疗质粒的提取
• 6.2.4 基因转染
• 6.2.5 Western blot 检测相关蛋白的表达
• 6.2.6 相关抗原免疫组化染色（ABC 法）
• 6.2.7 相关抗原免疫荧光染色
• 6.2.8 流式细胞仪分析细胞周期
• 6.2.9 Annexin V-FITC 检测细胞凋亡
• 6.2.10 细胞增殖活性的分析
• 6.2.11 U251 胶质瘤细胞侵袭能力的体外实验
• 6.2.12 统计学方法
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 治疗质粒的提取与鉴定
• 6.3.2 Western blot 检测相关蛋白的表达
• 6.3.3 细胞免疫组化与免疫荧光检测
• 6.3.4 细胞周期分析
• 6.3.5 细胞凋亡分析
• 6.3.6 MTT 实验
• 6.3.7 细胞侵袭能力的研究
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 第七章 载psiRNA 复合功能基因投递系统抑制 U251 人脑恶性胶质瘤的动物实验研究
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 实验试剂与仪器
• 7.2.2 动物模型的建立
• 7.2.3 治疗基因的提取
• 7.2.4 体内基因治疗
• 7.2.5 肿瘤生长情况观察
• 7.2.6 组织标本的常规HE 染色
• 7.2.7 免疫组织化学检测
• 7.2.8 原位细胞凋亡的检测
• 7.2.9 统计学处理
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 治疗质粒的大量提取
• 7.3.2 肿瘤生长曲线
• 7.3.3.H E 染色
• 7.3.4 治疗后肿瘤相关指标变化情况
• 7.3.5.T UNEL 原位凋亡检测
• 7.4 讨论
• 7.5 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文和科研情况