加压环境下采用不同保存方法及自制FM保存液对羊关节软骨及半月板保存的研究

论文摘要

由于人体运动的复杂性和连续性，关节面不可避免的反复接触并发生摩擦和变形，在机体功能异常的情况下，会引起关节软骨不同程度的磨损，带来一系列病理性的问题。中国目前有3600~4000万的骨关节炎患者，其中上百万的患者需要进行关节置换，同时每年也有大量患者因为意外事故需要进行关节置换的治疗。学者们根据天然关节软骨的特性研制各种人工关节假体解决此类问题，有研究发现人工关节假体植入人体后，在实现膝关节本身复杂运动的同时承受人体载荷，关节假体的安装面和配合面都会因为摩擦而产生磨损现象，最终引起假体的无菌性松动。为了最大限度减少假体松动，要预先对天然膝关节软骨和人工假体的生物摩擦学性能进行测试，目的在于再现临床磨损机制，使假体的各项性能接近天然软骨，天然关节软骨的摩擦学行为是生物摩擦学重要的研究内容。关节软骨的摩擦学问题也是生物力学领域的重要课题，又与关节接触力学密切相关。对大多数人来说，人体关节在承受很大的载荷、造成很高的接触压力的情况下能保证光滑运动达70年，主要原因是关节软骨具有低摩擦系数的润滑特性。尽管学者们已进行了多年研究，但对长期保持有效润滑过程的摩擦学机制仍不很清楚。天然关节软骨的体外摩擦学测试研究，对于关节保健、病变康复、假体植入以及仿生机械的研究都有重要的意义。国内外有大量的研究采用了不同的细胞来源、支架材料和生长因子来刺激和加快软骨组织的再生，但是只有少数的方法有实际转化为临床治疗方案的可行性，即使在这些方法中关节软骨长期的功能表现目前尚不清楚。更多的组织工程软骨的体外研究评估专注于新型材料的细胞生物学和生化特性，以分析和天然关节软骨的相似性。但是只有少数的研究调查天然软骨的生物力学和摩擦磨损性能，实际上后者具有更重要的意义。目前需要对天然关节软骨的摩擦学特点进一步研究，以使组织工程材料在细胞接种密度、培养时间、结构和功能、摩擦力学等方面更接近天然软骨。虽然许多体外研究都已对作为软骨替代品（例如水凝胶材料）的摩擦学性能做出评估，但是几乎没有学者直接对关节软骨本身做出合理的测试并同时阐明关节软骨的摩擦情况。其主要原因在于天然软骨离体后的生物学特性维持的时间较短，对其各项数值的测定有限，无法对天然关节软骨较长时间的摩擦学情况进行动态分析。找到一种便捷有效的软骨保存方法，延长软骨生物学活性的维持时间是解决问题的办法之一。目前国内外对关节软骨最常见的保存方式有以下几种，但是各有不足之处：1、新鲜冰冻保存法的优点为简单、便捷，缺点为：①存活细胞较少，②免疫原性较强；2、低温冷冻保存法的优点为可使组织的保存期限延长，缺点为供体的软骨细胞可能受到破坏；3、低压冻干或冷冻干燥保存法的优点为保存较为方便，缺点为：①导致整个基质的退变，②组织内的酶类发生破坏，③易发生形体皱缩；4、低浓度戊二醛保存法的优点为较好的保持生物特性，缺点为易引起缩水。本研究对天然软骨的保存方法进行探索，提出在加压条件下，自制的FM保存液可以更长时间的地维持软骨细胞的生物学活性。在6~9周的时间内，可以满足体外关节软骨摩擦学测试的要求。本实验定期取部分关节软骨组织进行组织学、组织化学、细胞存活率、超微结构、免疫组织化学等方面的检测。实验结果显示加压下的加压FM保存液组在保存1、3、6、9周后，关节的软骨细胞形态和细胞超微结构大体正常，基质粘多糖含量比较丰富，细胞存活率较高；而加压下的UW保存液组、正常条件下的UW保存液组和梯度降温组经过保存后的细胞大多出现细胞膜破裂的现象，细胞发生核固缩，细胞基质中粘多糖含量降低，细胞器结构不清，经统计学处理得知细胞存活率较低。经过加压FM保存液组保存的关节软骨组织抗原表达率更低，与加压下的UW保存液组、正常条件下的UW保存液组之间存在显著差异，有统计学意义(P<0.05)。不同的保存方法对各组的OD值（光吸收值）有影响并且各组之间有显著差异：加压FM保存液组有利于保持关节软骨细胞的活性，对关节软骨组织的损伤更小。在关节软骨细胞存活率方面和降低抗原表达率方面，加压FM保存液组与加压UW保存液组、正常条件下的UW保存液组之间有统计学意义(P<0.05)；加压FM保存液组和梯度降温组低温保存对维持关节软骨纤维软骨细胞活性和降低抗原表达率方面无明显区别，但更方便，保护作用更强。通过MTT法测量的OD值得知在软骨细胞活性方面，加压FM保存液组在第3、6周时和与加压UW保存液组、正常条件下的UW保存液组相比具有统计学差异(P<0.05)；第9周与梯度降温组之间有统计学差异(P<0.05)。实验二选取标本为半月板组织，分组同为为加压FM保存液组、加压UW保存液组、梯度降温组和非加压UW液组，主要通过光学显微镜和电子显微镜观察各组标本的微观变化情况。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 加压环境下采用不同保存方法及FM软骨保存液对羊关节软骨保存的研究
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验分组
• 1.4 实验操作
• 2 研究方法
• 2.1 肉眼观察
• 2.2 组织学观察
• 2.3 细胞存活率及统计学方法处理
• 2.4 免疫组织化学检测
• 2.5 MTT 法测定各标本中细胞的活性
• 3 结果
• 3.1 大体标本观察
• 3.2 组织学检查
• 3.3 测定细胞存活率及统计学方法处理
• 3.4 免疫组织化学检测
• 3.5 MTT 法测定细胞活性
• 4 讨论
• 实验二 采用不同保存方法及加压环境下FM软骨保存液对羊半月板保存的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 主要材料、仪器
• 1.2 实验分组
• 1.3 实验操作
• 2 研究方法
• 2.1 组织学观察
• 2.2 超微结构检查
• 3 结果
• 3.1 组织学观察
• 3.2 超微结构改变
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢