论文摘要
研究背景:小儿脓毒性休克是儿科重症监护的常见疾病,也是死亡的主要原因。脓毒性休克是由微生物及其毒素等产物引起微循环障碍和器官功能不全的危急重症,临床治疗十分棘手。目前,它的发病机制尚未完全明确。过去很长时间,人们从微循环学说来解释休克的发病机制,认为休克是一个以急性微循环障碍为主的综合征,是由于循环血容量减少,引起器官血液灌流不足和细胞功能紊乱。近年来,有学者对脓毒性休克发病机制提出了炎症失控学说,脓毒性休克并非细菌感染直接作用,而是机体对感染性因素的反应,反应启动后不再依赖原触发因素,常规的抗感染难以遏制这一进程。在脓毒性休克发生发展过程中,体内出现大量作用广泛而复杂的细胞因子,它们相互作用形成许多正反馈环而导致“瀑布效应”,使细胞因子过度产生,促进炎症反应。目前,该病的发病机制尚未完全明确,但是CD14作为LPS（脂多糖）受体,介导LPS性细胞反应,在脓毒性休克病理反应中对炎症介质的产生和释放起着关键的作用,越来越被人们重视。CD14能识别、结合LPS或LPS/LBP（脂多糖/月旨多糖结合蛋白）复合物,介导LPS所致的细胞反应,在LPS性炎症反应、脓毒性休克等病理反应中起重要作用。目前发现,内毒素是诱导休克和器官衰竭的主要介质之一。国外研究表明,阻滞内毒素的产生,抑制其活性,能减轻机体对细菌感染的一系列反应,降低脓毒性休克的病死率。但目前,国内类似研究及文献较少,因此我们进行了本课题研究。研究目的:本课题拟通过双功能光敏偶合剂Sulfo-SANPAH在体外进行2F9（我院自行研制的CD14单抗）与Genistein的交联来完成2F9-SANPAH-Genistein（简称2F9-Gen）的研制,研究其对表达mCD14单核细胞体外的靶向杀伤作用,可能为脓毒性休克的抗介质治疗研究提供一种治疗工具,同时为进一步研究脓毒性休克的发病机制奠定一定的理论基础。材料与方法:1.2F9亚类的鉴定用正常人的外周血单个核细胞,2F9杂交瘤培养上清,通过间接荧光标记法,流式细胞术检测2F9亚类。2.2F9腹水的制备、纯化和鉴定按常规方法制备大量腹水并经硫酸钱盐析初步纯化,并将初步纯化的2F9过Econo-PacR Protein A Cartridge纯化。纯化后2F9样品采用十二烷基磺酸钠-聚丙稀酸胺凝胶不连续电泳（SDS-PAGE）,考马斯亮蓝染色后,分析单抗重链和轻链分子量及抗体纯度估计。3.2F9-FITC的制备参考改良Marsshall法,用异硫氰酸荧光素（Fluoresceini sothiocyanate,FITC）标记纯化的2F9单抗,多余FITC经PBS充分透析除去,并用紫外分光光度计测定OD495及OD280值。4.2F9基础抗体的阻滞试验取2F9杂交瘤细胞培养上清1ml,按照常规流式细胞术检测法,观察其对自身直标单抗2F9-FITC和进口标准直标单抗CD14-FITC的阻滞效果。5.2F9-Gen的研制将直标纯化单抗2F9-FITC与Genistein（酪氨酸激酶抑制剂4′,5,7-三羟基异黄酮）在体外通过双功能光敏偶合剂Sulfo-SANPAH交联。6.2F9-Gen对单核细胞体外的靶向杀伤取适量正常人的外周血,分离出淋巴细胞并分别加入不同量的PBS,2F9,2F9-Gen及Gen,培养24小时后用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测。结果:1.2F9单抗亚型鉴定:鼠抗人抗体2F9的重链是亚型为IgG1;其轻链亚型为κ。2F9抗体亚型为鼠IgG1κ。2.2F9腹水的制备、纯化和鉴定经色谱分析柱过柱分离,杂蛋白与2F9单抗被完全分开。纯化后的2F9单抗经SDS-PAGE凝胶电泳,可见分子量为57.92KD的重链及30.29KD的轻链,未见其他杂蛋白条带,得到纯化的2F9单抗。3.直标单抗2F9-FITC的成功制备:采用改良Marsshall法,成功研制2F9-FITC,通过FCM检测发现,2F9-FITC与标准的CD14-FITC具有相当的特异性和敏感性。4.2F9-SANPAH浓度的检测2F9-SANPAH的浓度为0.35mg/ml（0.0019886mmol/L）。5.2F9-Gen的成功研制2F9-Gen的浓度为0.15mg/ml（0.0008571mmol/L）。6.2F9-Gen对单核细胞体外的靶向杀伤2F9-Gen和Gen在体外对单核细胞均有杀伤作用,但2F9-Gen杀伤作用大于Gen。结论:1.成功制备并纯化了2F9抗体。2.成功制备并纯化了直标抗体2F9-FITC。3.成功制备免疫毒素2F9-Gen。4.2F9-Gen在体外有较好的靶向杀伤单核细胞作用,可能为脓毒性休克提供了抗介质治疗的新途径,但是仍需进一步研究。
论文目录
相关论文文献
- [1].CD14在脓毒症中的最新进展[J]. 同济大学学报(医学版) 2016(06)
- [2].脑卒中患者血清可溶性CD14、同型半胱氨酸和7项血脂结果分析[J]. 分子诊断与治疗杂志 2017(02)
- [3].CD14启动子-159C/T多态性与呼吸道肺炎链球菌感染的相关性[J]. 中华医院感染学杂志 2020(19)
- [4].急性单核细胞白血病非特异性酯酶染色与CD14表达的比较[J]. 湖南中医药大学学报 2010(02)
- [5].急性胆道感染时肝组织脂多糖受体CD14的表达机制[J]. 第三军医大学学报 2009(08)
- [6].CD14基因多态性与强直性脊柱炎的关联性研究[J]. 北华大学学报(自然科学版) 2016(04)
- [7].梅山猪CD14基因-61位点的多态性及其与繁殖性能的关联分析[J]. 黑龙江畜牧兽医 2016(17)
- [8].新疆维吾尔、汉族CD14基因-159C/T多态性与变应性鼻炎关联分析[J]. 新疆医科大学学报 2015(06)
- [9].CD14在强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞和血清中的表达研究[J]. 新医学 2016(09)
- [10].抗CD14单克隆抗体对脓毒症大鼠肺组织趋化因子和可溶性细胞间黏附因子-1表达的影响[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2016(21)
- [11].CD14在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的表达及与严重程度的关系[J]. 齐齐哈尔医学院学报 2017(05)
- [12].CD14启动子-159位点基因多态性与中国延边地区原发性高血压左心室肥厚的关系[J]. 中国现代医学杂志 2016(17)
- [13].新疆维、汉人群CD14基因单核苷酸多态性的连锁不平衡和单倍型分析[J]. 新疆医科大学学报 2011(07)
- [14].阿尔茨海默病病人外周血单核细胞CD14的表达[J]. 青岛大学医学院学报 2015(04)
- [15].牙髓卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞CD14表达的影响[J]. 上海口腔医学 2010(05)
- [16].山东地区汉族人群类风湿关节炎与CD14基因多态性的关联性[J]. 山东大学学报(医学版) 2013(04)
- [17].维吾尔族CD14基因单核苷酸多态性和遗传结构分析[J]. 中国现代医学杂志 2011(16)
- [18].血浆可溶性CD14亚型在急性感染性疾病中的诊断和预后价值[J]. 国外医药(抗生素分册) 2020(01)
- [19].连续性血液净化对脓毒症急性肾损伤患者单核细胞CD14~+ HLA-DR表达的影响[J]. 中国中西医结合肾病杂志 2020(05)
- [20].CD14启动子-159位点基因多态性与糖尿病肾病患者肾动脉血流动力学研究[J]. 中国现代医学杂志 2013(36)
- [21].白细胞介素-7促进原发性肾病综合征患儿外周血CD14~+单核细胞活性[J]. 临床儿科杂志 2020(11)
- [22].CD14启动子-159位点基因多态性与幼年特发性关节炎的相关性研究[J]. 临床儿科杂志 2009(02)
- [23].冠心病患者CD14基因多态性与超敏C反应蛋白水平的相关性研究[J]. 四川医学 2009(08)
- [24].检测非霍奇金淋巴瘤患者外周血CD14+单核细胞组织因子和血管内皮生长因子的临床意义[J]. 中国医学科学院学报 2011(04)
- [25].脂多糖结合蛋白/CD14结合位点的初步定位[J]. 第三军医大学学报 2009(07)
- [26].心型脂肪酸结合蛋白和可溶性CD14亚型在丹参川芎嗪治疗脓毒症心肌损伤中的变化[J]. 实用医学杂志 2016(23)
- [27].CD14启动子-159位点基因多态性与糖尿病视网膜病变视网膜中央动脉血流动力学变化关系[J]. 实用医学杂志 2014(04)
- [28].CD14基因多态性与维吾尔族人群支气管哮喘的相关性研究[J]. 中国药物经济学 2013(06)
- [29].三条脂多糖结合蛋白/CD14结合位点模拟肽体外抗内毒素活性的比较研究[J]. 中国呼吸与危重监护杂志 2008(06)
- [30].冠心病患者CD14基因多态性与高敏C反应蛋白水平的关系[J]. 浙江医学 2008(02)