猪圆环病毒PCR诊断方法建立及标准制订

论文摘要

猪2型圆环病毒（Porcine circovirus 2, PCV2）与近年来世界各国普遍发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）密切相关,该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,给全球养猪业造成相当严重的经济损失。本研究建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法及同时检测PCV2、PPV和PRV的多重PCR方法。并应用此方法对河南省某大型猪场不同类型猪群疑似PCV2进行检测,旨在为PCV2的流行病学、疫病预防等相关领域的研究提供依据。主要内容及结果如下:（一）根据已报道的PCV2基因组序列,设计并合成了3对寡核苷酸引物,通过优化PCR的条件,成功地从PCV2感染的细胞中扩增出487bp片段,回收PCR产物测序,并用EcoRⅠ进行酶切,得到301 bp、186 bp的两条带,与预期的结果相符合,证实了该扩增片段的特异性,并对PRV DNA、PPV DNA和正常PK-15细胞基因组DNA的PCR扩增均为阴性,证明了PCR检测方法的特异性,PCR检测PCV2 DNA的最小量为0.1 pg。（二）在建立的PCV2和猪伪狂犬病毒（PRV）的单相PCR基础上,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了PCV2和PRV的复合PCR诊断方法,即利用一次PCR反应,可同时扩增PCV2的487 bp和PRV的355 bp特异性片段,而扩增相应的培养细胞（PK15）核酸结果均为阴性,对PCV2和PRV的最低检出量分别为100 pg和10 pg的DNA。该方法适合对PCV2和PRV的联合检测和鉴别诊断。（三）建立一种同时检测PCV2、PPV和PRV的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设一对特异性引物,用这3对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV进行检测,对其它几种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术能检出PCV2 100 pg、PPV 50 pg和PRV10 pg病毒的模板。该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• 文献综述
• 引言
• 试验一 应用PCR 方法检测猪圆环病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 分析讨论
• 试验二 复合PCR 检测猪圆环病毒和猪伪狂犬病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 分析讨论
• 试验三 多重PCR 检测PCV、PPV、PRV 方法的建立及其应用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论分析
• 猪圆环病毒PCR 诊断标准（草案）
• 参考文献
• 英文摘要
• 致谢