论文摘要
背景轮状病毒（rotavirus,RV）是导致全世界婴幼儿严重腹泻病的常见病原之一,每年可导致大约50万患儿死亡。无论发达国家还是发展中国家,RV的感染率和发病率都很高。因此迫切需要开发有效的疫苗和治疗策略来对抗病毒。而这些研究的基础又需要从根本上认识病毒作用于宿主细胞的分子机制。RV感染细胞的第一个关键步骤是病毒与被感染细胞表面的病毒受体结合。由于RV受体在宿主细胞上数量较少、性质复杂以及技术方法的局限性,其性质迄今不清。全长cDNA文库构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的一种重要方法之一,它有助于鉴定其基因组序列中的外显子-内含子的边界,分析基因编码区和理解基因在转录和翻译水平的功能,是分析人类基因表达图谱、功能和结构的重要资源。文库筛选作为一种获取未知功能基因的手段,对于研究病毒作用于人体的分子机制起着非常重要的作用。酵母双杂交技术自创立以来已成为研究蛋白质之间相互作用的重要方法之一。传统的酵母双杂交方法所研究的蛋白质间相互作用是在细胞核内完成的,而近年来在此基础之上发展起来的酵母双杂交衍生系统---Ras募集系统（RRS）,能够将蛋白质的相互作用定位于细胞膜上,更具备了灵敏度高、假阳性少等突出优点。RRS的应用原理为:酵母温度敏感株由于缺乏鸟苷酸交换因子（GEF）cdc25-2,而不能将外来信号传递给膜上的Ras蛋白,致使该种突变株在36℃不能存活;如果人为引入正常的GEF（Ras蛋白）,并使得GEF能与膜足够接近,则可弥补这一缺陷,激活Ras信号途径,使酵母细胞能够在36℃生长。目的在本研究中,我们构建一个婴幼儿小肠组织的全长cDNA文库并将其插入RRS系统中的pUra-MΔpolyA载体,构建成猎物载体,将其与本课题组前期构建好的RV外壳蛋白VP4诱饵载体pMet425-Myc-Ras-VP4共转化酵母温度敏感菌株cdc25-2,通过RRS筛选文库中与RVVP4相互作用的蛋白质分子,探寻轮状病毒与肠道宿主细胞相互作用的分子机制。方法1.从婴幼儿小肠组织中提取总RNA,并纯化mRNA,反转录合成第一、二链,连接EcoRI人工接头,分级分离后,除去小于500bpcDNA片段,与pUra-MΔpolyA连接后,CaCl2法转化感受态细胞DH5α,测定文库大小并EcoRI/XhoI双酶切鉴定插入cDNA片段的大小。2.将诱饵载体pMet425-Myc-Ras-VP4与猎物载体pUra-MΔpolyA-cDNA共转化酵母温度敏感菌株cdc25-2,通过改变培养基的营养成分及生长温度,去除可能的假阳性结果,筛选出与RVVP4相互作用的蛋白质分子。结果1.成功构建含有6×107重组子的婴幼儿小肠组织全长cDNA文库,插入片段的大小范围在0.5-2 kb之间,平均长度1.5kb。2.通过Ras募集系统,筛选出阳性克隆,序列测定尚在进行中。结论1.首次构建了一个婴幼儿小肠组织全长cDNA文库,并验证了插入片段大小符合进一步筛选所需,库容量亦足够大,是一个高质量的文库。2.利用RRS筛选系统筛选出了婴幼儿小肠组织全长cDNA文库中可能与RV外壳蛋白VP4相互作用的受体蛋白。
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