埃博拉病毒糖蛋白的毒性研究

论文摘要

埃博拉病毒是一种丝状病毒科单股负链无节段的RNA病毒。该病毒可导致埃博拉出血热,多表现为高热、休克及出血倾向。在疾病发展过程中,埃博拉病毒可损害血管内皮,进而导致血管通透性增加。目前己确定埃博拉病毒的毒性主要源自其表面的糖蛋白（GP）。内源性表达该蛋白可以导致血管内皮细胞失去粘附能力而脱落、漂浮,从而损害血管的完整性。本室建立了外源性携带Fc标签的糖蛋白GP1亚基（GP1-Fc）导致血管内皮细胞漂浮的模型。为进一步明确该模型中GP1-Fc毒性相关的结构域,本研究构建并表达、纯化了GP1相关的系列蛋白。同时发现了外源性添加的GP1-Fc蛋白以多聚体的形式存在,可能存在模拟天然GP分子构象的情况。此外,本研究还证实了在293T细胞中内源性表达GP不会直接导致细胞死亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语表
• 前言
• 第一部分 GP系列质粒的构建
• 1 实验材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 1.3 细胞株
• 1.4 工具酶、酶切缓冲液
• 1.5 主要化学试剂
• 1.6 细胞培养用耗材
• 1.7 试剂盒
• 1.8 主要仪器及设备
• 1.9 主要溶液配方
• 1.10 主要抗体
• 1.11 PCR引物
• 2 实验方法
• 2.1 质粒构建
• 2.2 细胞相关实验
• 3 实验结果
• 3.1 构建pEAK13CD5L Mucin TEVhFc质粒
• 3.2 构建pEAK13CD5L GP△TM TEVhFc质粒
• 3.3 构建pEAK13CD5L GP△Mucin TEVhFc质粒
• 3.4 构建pEAK13CD5L GP△Mucin△TM TEVhFc质粒
• 3.5 质粒大量提取
• 4 结论
• 第二部分 Mucin-Fc及GP△TM-Fc稳定表达细胞株的构建
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 DNA的纯化回收
• 2.2 细胞冻存
• 2.3 细胞复苏
• 2.4 稳定表达细胞株的构建
• 3 实验结果
• 3.1 Mucin-Fc稳定表达细胞株的构建
• 3.2 GP△TM-Fc稳定表达细胞株的构建
• 4 结论
• 1-Fc、Mucin-Fc及Fc蛋白的表达及纯化'>第三部分 GP₁-Fc、Mucin-Fc及Fc蛋白的表达及纯化
• 1 实验材料
• 1.1 试剂与耗材
• 1.2 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 蛋白纯化
• 2.2 蛋白浓度测定
• 3 实验结果
• 1-Fc蛋白表达及纯化'>3.1 GP₁-Fc蛋白表达及纯化
• 3.2 Mucin-Fc蛋白表达及纯化
• 3.3 Fc蛋白表达及纯化
• 3.4 纯化后蛋白的浓度测定
• 4 结论
• 1-Fc融合蛋白多聚体研究'>第四部分 GP₁-Fc融合蛋白多聚体研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 线性梯度native-PAGE
• 3 实验结果
• 3.1 线性梯度 native-PAGE
• 4 结论
• 第五部分 GP细胞毒性相关研究
• 1 实验材料
• 1.1 试剂与耗材
• 1.2 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 MTS检测细胞活力
• 2.2 台盼蓝染色法检测细胞死亡
• 3 实验结果
• 3.1 GP转染后细胞漂浮的情况
• 3.2 MTS检测细胞活力的结果
• 3.3 台盼蓝染色法检测漂浮细胞的死亡率
• 4 结论
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢