三种Ⅲ型蛋白影响黄单胞菌—水稻互作与植物抗病性研究

论文摘要

利用24个已知抗病基因的近等基因系材料对我国285个水稻白叶枯菌株的毒性进行了研究。除了IRBB51以外,含有多个抗病基因的水稻品种几乎对所有菌株都表现了高度的抗性。因此,我们选出对白叶枯菌株抗感反应有明显差异的13个含有单个抗病基因的水稻品种用于进一步的实验。IR24和IRBB10抗性很弱,仅对少数菌株具有抗性;而IRBB5、IRBB7以及IRBB21则具有较高的抗性,对大多数菌株表现出高度的抗性。其它单基因品种如IRBB2、IRBB3、IRBB4、IRBB7、IRBB13等在菌株间的抗感反应有着显著的差异。因此,根据白叶枯病菌与近等基因系水稻之间的互作,我们筛选出6个单基因品种（IRBB5,IRBB13,IRBB3,IRBB14,IRBB2,IR24）作为鉴别品种,从而将我国的白叶枯病菌菌株划分为9个小种,其互作模式依次为:RRRRRR、RRRRRS、RRRRSS、RRRSSS、RRSSSS、RSRRRS、RSSRRS、RSSSSS、SSSSSS,对应小种频率分别为10.18%、10.53%、4.91%、10.18%、24.21%、5.96%、11.23%、22.46%、0.35%。我国白叶枯菌株的毒性呈现多样性,不同时期、不同地区菌株毒性差异明显。与菲律宾菌株的毒性进行比较,也存在较大的差异。通过构建Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99的hrpA、hrpF基因突变菌株PXO99/PMD-A（AOS）、PXO99/PMD-F（FOS）及其功能互补菌株AOS/pUFR034∷hrpA（cAOS）、FOS/pUFR034∷hrpF（cFOS）,并分别对之进行GFP荧光标记,产生PXO99/pHM1∷gfp（PXO99-GFP）、AOS/pHM1∷gfp（AOS-GFP）、FOS/pHM1∷gfp（FOS-GFP）、AOS/pHM1∷hrpA∷gfp（cAOS-GFP）、FOS/pHM1∷hrpF∷gfp（cFOS-GFP）,对水稻-白叶枯病菌互作进行研究。用PXO99、AOS、FOS、cAOS、cFOS、PXO99-GFP、AOS-GFP、FOS-GFP、cAOS-GFP、cFOS-GFP分别处理水稻及烟草。GFP标记菌株与非GFP标记菌株对水稻的致病性及在烟草上形成HR的能力没有明显差别。突变体FOS对水稻的致病性减弱,AOS几乎完全丧失了对水稻的致病性,形成褐斑。FOS仍然具有诱导烟草形成HR的能力,而AOS同时丧失了在烟草上形成HR的能力。功能互补菌株cAOS、cFOS对水稻的致病性比突变体有所恢复,但达不到野生型的水平。cAOS不能恢复AOS在烟草上形成HR的能力,cFOS仍然可诱导烟草叶片形成HR。病原菌喷雾处理水稻叶片的荧光观察显示,野生型菌株、功能互补菌株、突变体FOS-GFP通过伤口及自然孔口形成侵染,而突变体AOS不能形成侵染。电镜观察结果表明,野生型菌株多数以聚集的方式吸附在自然孔口周围,而突变菌株AOS则多数以分散的形式吸附于水稻叶片表面。以上结果显示,hrpA的突变可能对菌株的识别及聚集能力产生了影响,从而影响了菌株的侵染。已有研究试图确定harpins在植物细胞中的作用部位。但对不同的harpins如来自Erwinia amylovora的HrpNEa、Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的HrpNPsph等研究结果都不尽相同。因此,harpins的识别部位、结合受体等一直不清楚,在本研究中,作者利用荧光蛋白标记构建融合蛋白,以便今后进一步研究HrpA、HrpF在水稻上的作用部位。HrpAXoo、HrpFXoo和HrpAXooc、HrpFXooc分别是由水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的hrpA、hrpF基因编码产生的蛋白质。从水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌中分别克隆hrpA和hrpF基因,与gfp（green fluorescent protein）构建融合基因,连接pET30a（+）载体,获得了重组质粒pET30a（+）∷hrpAXoo∷gfp、pET30a（+）∷hrpAXooc∷gfp、pET30a（+）∷hrpFXoo∷gfp和pET30a（+）∷hrpFXooc∷gfp,转化宿主菌BL21（DE3）产生表达菌株pAGGE、pARGE、pFGGK和pFRGK。表达菌株经IPTG诱导培养,收集菌体,超声波破碎后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,分别产生94.6 kD、94.8 kD、116.3 kD、116.3 kD大小的组氨酸标记的目的蛋白质与GFP的融合蛋白条带。水稻细菌性条斑病菌HpaGXooc蛋白质作为harpin效应分子可促进植物生长、诱导过敏性细胞死亡、诱导植物对病原菌的抗病性。其编码基因hpaGXooc包含两个富含甘氨酸的结构域（glycine-rich motif,GRM）和一个半胱氨酸（cysteine）。GRM是harpin类蛋白的共同特征,而一般harpin类蛋白结构中则不含有半胱氨酸。我们对hpaGXooc的GRM进行了缺失突变得到突变体hpaGXoocMG（MG）,对hpaGXooc的半胱氨酸位点进行定点突变,将其半胱氨酸突变成苏氨酸得到突变体hpaGXoocC47T（C47T）。hpaGXooc、MG、C47T经体外表达得到HpaGXooc、MG和C47T。用它们分别处理烟草,MG和C47T诱导烟草产生的死亡细胞数目分别是HpaGXooc的1.7和1.2倍;标记基因hin1、hsr203的表达结果与之一致。MG和C47T处理的植株的抗病性也明显增强。以HpaGXooc、MG、C47T处理的烟草再接种病斑TMV病毒,5天后调查,三种蛋白处理的植株叶片病斑分别减少了58%、92%、81%;以Pseudomonas syringae pv.tomato（DC3000）接种番茄,5天内对病原菌进行持续分离,统计其细胞数目。经HpaGXooc、MG、C47T处理的番茄上的病原菌的数目分别约为对照的1/160、1/15860、1/1260。防卫相关基因Chia5、NPR1、PR-1a的表达结果与之一致。HpaGXooc、MG和C47T还可促进番茄生长,地上部分的增长幅度分别为15%、46%、125%、;地下部分的增长幅度分别为53%、106%、77%。细胞延展与生长相关基因EXP2的表达情况与之一致。这些结果说明HpaGXooc中富含甘氨酸的区域以及半胱氨酸的存在抑制了蛋白本身对植物的效应。HpaGXooc、HrpFXooc、HrpAXooc作为水稻细菌性条斑病菌的Ⅲ型蛋白,与病原菌的致病性密切相关。HpaGXooc作为效应分子,HrpFXooc参与病原菌Ⅲ型泌出系统通过寄主植物的转运结构的形成。HrpAXooc可能参与病原菌Ⅲ型泌出系统的泌出结构的形成。三者之间是否存在某种关系呢?通过酵母双杂交系统探讨Ⅲ型蛋白HrpAXooc、HrpFXooc与HpaGXooc之间的关系。分别构建AD载体pGADT7∷hrpAXooc、pGADT7∷hrpFXooc和DNA-BD载体pGBKT7∷hpaGXooc、pGBKT7∷MG、pGBKT7∷C47T。AD载体与DNA-BD载体共转化酵母菌株Y190,β-Galactosidase Assays显色表明,HrpAXooc、HrpFXooc与HpaGXooc、MG、C47T之间不存在直接的互作。本研究的创新点:（1）通过突变体阐释Ⅲ型蛋白HrpA和HrpF在水稻-黄单胞菌互作中的功能;（2）通过对HpaGXooc的结构的改变,明确Ⅲ型效应子HpaGXooc的关键结构特征对其植物效应的影响;（3）通过酵母双杂交系统探讨Ⅲ型蛋白HrpAXooc、HrpFXooc与HpaGXooc之间的关系。本研究的缺点:有些地方文字描述不够准确,个别地方缺乏统计数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 第一章 水稻白叶枯病菌的致病力分化
• 第二章 植物病原细菌的Ⅲ型泌出系统
• 第三章 植物病原细菌的hrp基因
• 研究报告
• 第一章 中国水稻白叶枯病菌的毒性分析与小种鉴别
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果分析
• 2.1 水稻近等基因系对病菌小种鉴别能力分析
• 2.2 小种鉴别体系的建立
• 2.3 中国水稻白叶枯病菌致病多样性
• 2.4 不同时期菌株的小种分析
• 2.5 中国白叶枯菌株小种毒性与菲律宾小种毒性比较
• 2.6 病菌小种的地区分布
• 3 讨论
• ABSTRACT
• 第二章 水稻黄单胞菌Ⅲ型蛋白编码基因hrpA和hrpF功能研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 hrpA和hrpF突变体产生
• 2.2 突变体功能互补菌株的产生
• 2.3 GFP标记菌株的产生
• 2.4 hrpA和hrpF突变对水稻致病性的影响
• 2.5 侵染过程的电子显微镜和荧光显微镜表现
• 2.6 hrpA和hrpF突变对烟草过敏反应的影响
• 3 讨论
• ABSTRACT
• 第三章 水稻黄单胞菌HrpA与HrpF的GFP融合蛋白的体外表达
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• ABSTRACT
• Xooc植物效应的研究'>第四章 富含甘氨酸的重复单元及半胱氨酸的结构组分抑制HpaG_Xooc植物效应的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• ABSTRACT
• Xooc、HrpF_Xooc与HpaG_Xooc相互关系研究'>第五章 水稻细菌性条斑病菌HrpA_Xooc、HrpF_Xooc与HpaG_Xooc相互关系研究
• 摘要
• 1材料与方法
• 2 结果
• ABSTRACT
• 参考文献
• 发表和待发表的论文目录
• 致谢