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人血管抑制因子vasostatin片段在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性检测

2020-11-22阅读(126)

人血管抑制因子vasostatin片段在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性检测

论文摘要

Vasostatin是一种新型的血管生成抑制因子,为钙网素（Calreticulin）蛋白N′端结构域片段第1-180个氨基酸,具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成的生物功能,其主要活性部位存在于第120-180个氨基酸片段中。为了确定vasosatatin蛋白的更短活性片段,本实验以含全长人vasostatin蛋白cDNA序列的质粒pUC18为模板,PCR扩增四条不同长度的vasostatin片段,分别插入到质粒pGEX-4T-3的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点间,构建成重组质粒pGEX-4T-3/vasostatin-A、pGEX-4T-3/vasostatin-B、pGEX-4T-3/vasostatin-C以及pGEX-4T-3/vasostatin-A-C,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导GST融合蛋白表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,改变诱导条件可增加可溶性表达量,包涵体形式的表达量约占菌全蛋白总量的55%。通过GST亲和凝胶纯化目的蛋白并用凝血酶（Thrombm）酶切后获得单体vasostatin片段,采用MTT法检测其抑制内皮细胞增殖的活性,结果表明各GST-vasostatin及vasostatin片段具有程度不同的抑制bFGF诱导的内皮细胞增殖活性,其中以片段vasostatin-B（含氨基酸135-164）的抑制活性最为显著。可知人vasostatin片段中的氨基酸135-164区域是活性较强的区域,为进一步对其生物活性及作用机理的研究奠定了基础。此研究可能为肿瘤及其它血管生成相关疾病的治疗提供新的策略。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 目录
  • 绪论
  • 正文
  • 1.材料、试剂及仪器
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 工具酶及主要试剂
  • 1.3 主要实验仪器
  • 2.实验思路及技术路线图
  • 3.实验方法
  • 3.1 pGEX-4T-3质粒的酶切鉴定
  • 3.2 目的基因的PCR扩增
  • 3.3 重组质粒的构建与鉴定
  • 3.4 重组菌株的诱导表达
  • 3.5 目的蛋白的发酵表达及表达条件的动力学分析
  • 3.6 包涵体形式的目的蛋白的处理
  • 3.7 重组vasostatin片段融合蛋白的纯化和凝血酶裂解
  • 3.8 细胞活性检测
  • 4 实验结果
  • 4.1 载体质粒pGEX-4T-3的酶切鉴定
  • 4.2 目的片段的PCR扩增
  • 4.3 重组菌株的构建与鉴定
  • 4.4 重组片段的诱导表达
  • 4.5 目的蛋白的发酵表达及表达条件动力学分析
  • 4.6 包涵体的溶解和复性
  • 4.7 重组蛋白的纯化和凝血酶切割
  • 4.8 Vasostatin片段对血管内皮细胞的抑制效应
  • 5 实验讨论
  • 5.1 实验设计的理论根据
  • 5.2 表达系统的选择
  • 5.3 表达质粒的选择
  • 5.4 解决包涵体形成的策略初步探讨
  • 5.5 GST融合蛋白的亲和层析纯化
  • 5.6 MTT法检测目的片段对血管内皮细胞增殖的抑制作用
  • 5.7 工作展望
  • 结论
  • 参考文献表
  • 附录
  • 1.Vasostatin 120-180的基因序列及酶切位点
  • 2.pGEX-4T-3/vasostatin-A测序图谱
  • 3.pGEX-4T-3/vasostatin-A测序图谱
  • 4.pGEX-4T-3/vasostatin-A测序图谱
  • 5.pGEX-4T-3/vasostatin-A-C测序图谱
  • 致谢

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