平邑甜茶MhMAPK基因的分离、功能鉴定及其信号转导作用

论文摘要

促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase , MAPK）是MAPK级联信号转导途径中的关键酶,在植物生长发育和胁迫信号传递中起重要作用。平邑甜茶（Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var pinyiensis Jiang）是苹果常用砧木,本文以平邑甜茶为试材,克隆了MAPK基因全长、分析了其基因序列与编码蛋白,还研究了胁迫下MAPK基因表达与蛋白活性,主要结果如下:1.利用RT-PCR技术结合RACE技术获得了平邑甜茶MAPK基因,命名为MhMAPK。GenBank注册号为EF427897。2. MhMAPK编码的蛋白质特性分析表明,该蛋白具有MAPK蛋白的典型结构,即含有11个保守的蛋白激酶亚区,在第Ⅶ和第Ⅷ个亚区之间有一个非常保守的TxY基序,并且含有蛋白激酶所具有的结构域。3.构建了pBIN-GFP-MhMAPK表达载体并使其在洋葱表皮中表达,结果表明,MhMAPK定位在细胞核内,同时利用ProtComp Version 6.1软件分析的结果也表明该蛋白定位于细胞核内。4.构建了pBI121-MhMAPK正义表达载体并转化农杆菌LBA4404,并对烟草进行了农杆菌侵染,获得了转基因烟草植株。此外,还构建了pBI121-3’segment反义表达载体,从而为转反义基因提供了基础。5.盐胁迫、干旱胁迫、CdCl2和CuCl2胁迫以及SNP （NO供体）均能显著提高MhMAPK基因的表达量,并且SNP,CdCl2和CuCl2均能增加平邑甜茶中MAPK活性,同时,在CdCl2和CuCl2胁迫过程中,检测到NO的产生,这表明在铜、镉胁迫过程中,NO可能作为信使分子在铜,镉胁迫下起着信号传递的作用,并且NO激活的MAPK级联途径起着重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 植物中的MAPK
• 1.2 植物MAPK 级联途径（MAPK cascades）
• 1.3 MAPK 级联途径在环境胁迫中的信号转导作用
• 1.3.1 MAPK 级联途径在非生物胁迫中的信号转导作用
• 1.3.2 MAPK 级联途径在生物胁迫中的信号转导作用
• 1.4 MAPK 在激素信号传递中的作用
• 1.4.1 MAPK 在生长素信号传递中的作用
• 1.4.2 MAPK 在ABA 信号传递中的作用
• 1.4.3 MAPK 在乙烯信号传递中的作用
• 1.4.4 MAPK 在赤霉素信号传递中的作用
• 1.4.5 MAPK 在水杨酸信号传递中的作用
• 1.5 MAPKs 与信号分子之间的相互作用
• 1.6 MAPK 级联途径信号转导的特异性
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 植物材料总RNA 的提取
• 2.2.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化（用于5’RACE）
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾（用于5’RACE）
• 2.2.5 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.6 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.8 碱法小量质粒DNA 的提取
• 2.2.9 凝胶电泳中DNA 片段的回收
• 2.2.10 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.11 DNA 序列测定
• 2.2.12 MhMAPK 基因正义表达载体的构建
• 2.2.13 MhMAPK 基因反义表达载体的构建
• 2.2.14 pBI121-MhMAPK-GFP 表达载体的构建
• 2.2.15 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.16 实时荧光定量PCR 分析
• 2.2.17 MAPK 活性的测定
• 2.2.18 NO 含量的测定
• 2.2.19 抗氧化酶活性及活性氧的测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 平邑甜茶MhMAPK 基因克隆与序列分析
• 3.1.1 MhMAPK 基因的分离
• 3.1.2 平邑甜茶MhMAPK 基因的序列分析
• 3.1.3 MhMAPK 与其他MAPK 基因的聚类分析
• 3.2 平邑甜茶MhMAPK 编码蛋白的特性分析
• 3.2.1 MhMAPK 基因编码蛋白的氨基酸分析
• 3.2.2 MhMAPK 基因编码的蛋白结构域分析
• 3.2.3 MhMAPK 基因编码的蛋白疏水性分析
• 3.3 平邑甜茶MhMAPK 的亚细胞定位
• 3.3.1 表达载体pBI121-MhMAPK-GFP 的构建
• 3.3.2 MhMAPK 在洋葱表皮中的亚细胞定位
• 3.4 平邑甜茶MhMAPK 表达载体构建
• 3.4.1 转基因烟草正义表达载体pBI121-MhMAPK 的构建
• 3.4.2 反义表达载体pBI121-anti-MhMAPK 的构建
• 3.5 平邑甜茶MhMAPK 对逆境胁迫的响应
• 3.5.1 平邑甜茶MhMAPK 基因的表达分析
• 3.5.2 平邑甜茶MAPK 蛋白的活化特性分析
• 3.5.3 铜、镉胁迫对平邑甜茶内源NO 含量变化的影响
• 3.5.4 NO 对铜、镉胁迫下平邑甜茶幼苗活性氧代谢的影响
• 4. 讨论
• 4.1 平邑甜茶MhMAPK 基因的克隆与表达特性分析
• 4.2 NO 诱导的MAPK 途径在平邑甜茶对重金属胁迫反应中的作用
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成论文情况