酶解麦麸制备阿魏酰低聚糖及其生物活性的研究

论文摘要

大量流行病学研究结果表明谷物中的酚酸类物质对慢性疾病的预防起着关键性的作用。阿魏酸是谷物中含量最丰富的酚酸,它通过酯键与细胞壁中阿拉伯木聚糖侧链上的一些阿拉伯糖残基相连,以结合态的形式存在。小麦是世界上最重要的粮食作物之一,是人类膳食的重要组成部分。小麦麸皮细胞壁多糖经适度的酸或多糖水解酶处理可以获得阿魏酰低聚糖（FOs）。FOs具有卓越的生物活性,能够有效地抑制脂蛋白的过氧化,在阻止或减缓动脉硬化进程等方面可能具有重要意义。到目前为止,有关阿魏酰低聚糖方面的研究,国内还没有报道。因此,本研究利用Bacillus subtilis木聚糖酶水解麦麸不溶性膳食纤维制备FOs,并对其生物活性进行评价,进一步应用量子化学计算表征FOs的一些理论参数（如酚O-H的解离能和疏水参数）,从理论上阐述FOs的构效关系。选择浓度为100 mg/mL的分离胶,375 mmol/L pH 9.0 Tris/盐酸分离胶缓冲液,50 mmol/L Tris/384 mmol/L甘氨酸（pH 8.3）电极缓冲液的电泳体系,分离B. subtilis木聚糖酶可以获得良好的分辨率。采用Native PAGE和均质提取法相结合从B. subtilis木聚糖酶中分离纯化了两种内切木聚糖酶,将它们分别定义为xylⅠ和xylⅡ,它们的比活力分别为193.2和472.1 U/mg蛋白质。由此说明这种以Native PAGE和均质提取相结合的分离纯化内切木聚糖酶的方法能够很好地保持酶的生物活性,具有快速、简便和高效等优点。内切木聚糖酶xylⅠ和xylⅡ具有相同的最适反应温度（50℃）和最适pH（7.0）。Mn2+对酶反应具有促进作用,将酶活提高了2.7倍,而Fe3+对酶反应起完全抑制作用。SDS-PAGE分析结果表明内切木聚糖酶xylⅠ的分子质量约为53.0 kDa,xylⅡ的分子质量约为98.8 kDa。以桦木木聚糖为底物,内切木聚糖酶xylⅠ的Km=1.11 mg/mL,Vmax=0.22 mgmL-1min-1,xylⅡ的Km=3.07 mg/mL,Vmax=0.57 mgmL-1min-1。利用耐高温α?淀粉酶、水解蛋白酶和精制糖化酶处理小麦麸皮样品得到不溶性膳食纤维,得率在40%左右,其中戊聚糖含量约占54.7%,阿魏酸约占0.90%。B. subtilis木聚糖酶水解麦麸不溶性膳食纤维能够释放出FOs。采用一种5水平,5因子的中心组合旋转设计优化了制备FOs的酶解生物过程,得到FOs浓度最大时酶解反应条件,即:反应温度42℃,pH 5.2,反应时间35 h,酶量4.8 g/L,底物浓度120 g/L。FOs用Amberlite XAD、Sephadex LH 20进行纯化,高效液相色谱（HPLC）和高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）分析结果揭示FOs由酯化的阿魏酸、阿拉伯糖和木糖所组成。紫外光谱分析表明FOs的MOPS缓冲液在325 nm处有最大吸收值。红外光谱分析表明FOs在990 cm-1处有一低强度的肩峰,说明阿拉伯糖基的存在,并且与吡喃型木糖O-3位相连;在1731 cm-1处有酯键的特征吸收峰。首次采用在线高效液相色谱与电喷雾多级串联质谱联用技术（HPLC-ESI-MSn）对FOs进行分析,推测FOs中两个主要化合物的结构为O-木糖基-[5-O-（阿魏酰基）-α-阿拉伯糖基

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 小麦麸皮阿魏酰低聚糖
• 1.2 FOs 的生物活性
• 1.2.1 调控植物的生长发育
• 1.2.2 抗氧化活性
• 1.3 FOs 的生物利用度
• 1.4 小麦麸皮生理活性物质研究概况
• 1.4.1 阿拉伯木聚糖
• 1.4.2 低聚木糖
• 1.4.3 植酸
• 1.4.4 阿魏酸
• 1.5 立题背景和立题意义
• 1.6 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 Native PAGE 纯化Bacillus subtilis 内切木聚糖酶及其性质
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要实验仪器
• 2.2.3 主要实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 B. subtilis 木聚糖酶Native PAGE 方法分离效果优化
• 2.3.2 Native PAGE 和均质提取法相结合分离纯化B. subtilis 木聚糖酶
• 2.3.3 内切木聚糖酶的鉴定
• 2.3.4 内切木聚糖酶xyl Ⅰ和xyl Ⅱ的酶学性质
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 酶法制备阿魏酰低聚糖
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验材料与化学试剂
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.2.3 主要实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 麦麸不溶性膳食纤维的制备
• 3.3.2 温度和pH 对B. subtilis 木聚糖酶活力及稳定性的影响
• 3.3.3 B. subtilis 木聚糖酶对桦木木聚糖的作用
• 3.3.4 B. subtilis 木聚糖酶对麦麸不溶性膳食纤维的作用
• 3.3.5 木聚糖酶对FOs 生产的影响
• 3.3.6 底物浓度对FOs 生产的影响
• 3.3.7 酶解条件的优化
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 阿魏酰低聚糖的结构特征
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料和主要化学试剂
• 4.2.2 主要实验仪器
• 4.2.3 主要实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 FOs 的分离
• 4.3.2 FOs 的组成分析
• 4.3.3 FOs 的紫外光谱分析
• 4.3.4 FOs 的红外光谱分析
• 4.3.5 FOs 电喷雾电离质谱（ESI-MS）
• 4.3.6 FOs 的液相色谱电喷雾多级串联质谱分析
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 阿魏酰低聚糖的生物活性
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料和主要化学试剂
• 5.2.2 主要实验仪器
• 5.2.3 主要实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 糖类对B. bifidum F-35 生长的影响
• 5.3.2 FOs 体外促进B. bifidum F-35 生长作用
• 5.3.3 FOs 对Fe2+的螯合作用
• 5.3.4 FOs 对H202 的清除作用
• 5.3.5 FOs 对˙OH 自由基的清除作用
• 5.3.6 FOs 对DPPH˙自由基清除作用
• 5.3.7 FOs 对过氧自由基诱导小鼠红细胞溶血的抑制作用
• 5.3.8 FOs 对蛋白质非酶糖基化反应的抑制作用
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 阿魏酰低聚糖对AAPH 损伤人红细胞的保护作用机制
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料和主要化学试剂
• 6.2.2 主要实验仪器
• 6.2.3 主要实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 应用量子化学计算法计算表征FOs 的一些理论参数
• 6.3.2 FOs 对AAPH 诱导人血红细胞溶血的抑制作用
• 6.3.3 扫描电镜观察FOs 对AAPH 损伤的人血红细胞表面形态的影响
• 6.3.4 FOs 对AAPH 诱导人血红细胞脂质过氧化的影响
• 6.3.5 FOs 对AAPH 诱导人血红细胞谷胱甘肽含量变化的影响
• 6.3.6 FOs 对高铁血红蛋白产生的影响
• 6.3.7 FOs 对AAPH 诱导人血红细胞膜蛋白质变化的影响
• 6.3.8 AAPH 诱导人血红细胞溶血的机制
• 6.3.9 FOs 对人血红细胞受氧化伤害的保护机制
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 论文主要结论
• 论文创新点
• 攻读博士学位期间取得的学术成果
• 致谢
• 附录：符号、缩略语及其意义