水稻悬浮细胞胞外蛋白的分析

论文摘要

质外体是植物细胞的重要结构。质外体蛋白参与了植物的生长发育、形态建成、细胞的分裂和增殖、细胞识别和信号转导等一系列生理过程。研究表明,悬浮培养细胞中存在一些条件培养因子,能够负责早期细胞增殖分裂活性。本论文主要利用差异蛋白质组学的方法从水稻悬浮细胞的胞外介质中找寻与细胞生长和增殖有关的质外体蛋白,并对其功能进行进一步研究。首先以水稻日本晴种子为材料,建立了生长状态良好的水稻悬浮系。通过对悬浮细胞生长曲线的观察,确定分别提取培养第三天、六天和九天的悬浮细胞胞外介质蛋白。通过测定细胞内苹果酸脱氢酶活性和免疫印迹检测微管蛋白的表达来评估所提取蛋白样品中胞内蛋白的污染程度,结果表明均不含有细胞内蛋白的污染。进一步研究所提取的胞外介质蛋白对悬浮细胞的生长作用,表明第三天胞外介质蛋白明显的促进了悬浮细胞生长量的增加,而第六天和九天的胞外介质蛋白无作用。使用双向电泳分离了具有不同功能的第三天和六天的胞外介质的差异表达蛋白,发现第三天和六天的蛋白样品中具有明显的差异,共检测出十一个表达量发生变化的蛋白点,其中十个点质谱鉴定得到阳性结果,分别属于七种蛋白。生物信息学分析表明,这七个蛋白均具有信号肽,可能为分泌蛋白。通过亚细胞定位对其中三个蛋白:半胱氨酸蛋白酶（OsCP）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（OsCPI）和碱性分泌蛋白（OsBSP）进行分析表明,OsCPI和OsBSP可以定位于细胞壁上,OsCP呈泡状分布。同时利用实时定量PCR检测OsCP、OsCPI和OsBSP在不同培养天数的悬浮细胞的转录水平表达情况表明,OsCPI和OsBSP的RNA变化趋势与蛋白变化趋势相一致,而OsCP的RNA变化趋势与其蛋白变化趋势相反,可能由于翻译后修饰造成。另外为了更加了解水稻悬浮细胞胞外介质蛋白的组分,我们通过单向电泳和LC/MS-MS联用,对第三天胞外介质蛋白进行鉴定,结果得到α-amylase、过氧化物酶等一些已知的质外体蛋白。在双向电泳检测出的差异蛋白中,OsCP是在第三天胞外蛋白中表达量高,此样品能够促进悬浮细胞增殖。OsCPI在第六天胞外蛋白中检测出,而三天蛋白中未见其表达。这一有趣的现象引起我们的关注,因此对于OsCP和OsCPI在悬浮细胞中的作用,进行了进一步的研究。通过构建OsCP RNAi的双元载体,遗传转化水稻愈伤组织,最终建立3个转基因水稻的悬浮系。Sourthern-blot分析表明3个悬浮系均为不同T-DNA插入的株系。实时定量PCR分析表明3个悬浮系中OsCP的表达量均下降。对3个OsCP RNAi的悬浮系的鲜重和干重的增长率统计显示,与空载体对照相比,其增长率均下降。细胞直径测量统计分析表明,悬浮细胞的大小并未受到影响。同时纯化OsCPI融合GST标签的重组蛋白,蛋白活性检测表明纯化蛋白可以抑制木瓜蛋白酶的活性。将10-7、10-8 M的OsCPI外加到野生型的悬浮培养基中,发现其蛋白抑制了水稻悬浮细胞的生长,并且抑制作用具有剂量依赖性,而且同时影响了水稻悬浮细胞的状态和降低细胞外蛋白酶的活性。10-7 M的OsCPI加入到烟草BY-2悬浮细胞中并未影响其细胞的生长,表明OsCPI对悬浮细胞生长的抑制作用具有物种特异性。以上研究利用双向电泳和质谱分析等技术手段,对可能影响水稻悬浮细胞生长的质外体蛋白进行鉴定,对其中两个蛋白半胱氨酸蛋白酶（OsCP）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（OsCPI）进行后续的研究。结果表明蛋白酶和抑制剂作为细胞外蛋白,可能参与了水稻悬浮细胞生长的调节过程。

论文目录

• 缩写表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 一 植物质外体的研究进展
• 1 植物质外体
• 1.1 植物细胞壁
• 1.2 植物细胞壁间隙空间
• 1.3 质外体的功能
• 2 植物质外体蛋白
• 2.1 植物细胞壁结构蛋白
• 2.1.1 Extensin
• 2.1.2 AGPs
• 2.1.3 GRPs
• 2.2 细胞壁酶蛋白
• 2.2.1 Invertase
• 2.2.2 Expansin
• 2.2.3 Chitinase
• 2.3 植物细胞外多肽
• 2.3.1 systemin
• 2.3.2 PSK
• 2.3.3 SCR
• 2.3.4 CLAVATA 3
• 2.3.5 其他细胞外多肽信号分子
• 3 研究植物质外体蛋白分离鉴定的组学方法及其进展
• 3.1 质外体蛋白的提取
• 3.1.1 非损伤提取（non-disruptive）方法
• 3.1.2 损伤提取（disruptive）方法
• 3.2 质外体蛋白的分离和鉴定
• 3.2.1 生化和蛋白质组的方法
• 3.2.2 生物信息学的方法
• 3.2.3 其他方法
• 3.3 质外体分泌蛋白的蛋白质组的研究
• 二 植物半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂的研究进展
• 1 植物半胱氨酸蛋白酶
• 1.1 植物半胱氨酸蛋白酶分类及其特点
• 1.1.1 半胱氨酸蛋白酶分类
• 1.1.2 半胱氨酸蛋白酶的特点
• 1.1.3 植物半胱氨酸蛋白酶的合成、运输
• 1.1.4 植物半胱氨酸蛋白酶的亚细胞定位
• 1.2 植物半胱氨酸蛋白酶基因及其调控
• 1.3 植物半胱氨酸蛋白酶功能研究
• 1.3.1 参与贮存蛋白的降解和沉积
• 1.3.2 参与衰老和细胞程序性死亡
• 1.3.3 参与对非生物胁迫和生物胁迫的响应
• 1.3.4 其他重要功能
• 2 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 2.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 2.2 水稻中的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 第二部分 研究论文
• 引言
• 一 水稻悬浮细胞增殖过程中胞外介质蛋白的分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 培养基及培养条件
• 1.3 质粒和菌种
• 1.4 引物合成及DNA 序列测定
• 1.5 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 水稻愈伤组织诱导及继代
• 2.2 悬浮系的建立及状态检测
• 2.3 悬浮系细胞生长曲线的制作
• 2.4 不同天数悬浮介质中的胞外蛋白提取
• 2.5 蛋白质定量
• 2.6 苹果酸脱氢酶（MDH）活性的测定
• 2.7 蛋白电泳和免疫印迹检测
• 2.8 不同天数胞外蛋白对悬浮生长影响的测定
• 2.9 双向电泳
• 2.10 图像扫描及数据分析
• 2.11 差异蛋白点的质谱鉴定
• 2.12 RNA的提取及反转录生成cDNA
• 2.13 外源片段的扩增
• 2.14 DNA 琼脂糖电泳和片段的回收
• 2.15 DNA片段的连接
• 2.16 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2法转化大肠杆菌'>2.17 CaCl₂法转化大肠杆菌
• 2.18 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 2.19 DNA酶切
• 2.20 基因枪法转化洋葱表皮
• 2.21 实时荧光定量PCR
• 3 实验结果
• 3.1 水稻悬浮系的建立及细胞的活性检测
• 3.2 水稻悬浮细胞生长曲线的制作
• 3.3 悬浮系胞外蛋白的提取及胞内污染的检测
• 3.4 不同胞外蛋白对于悬浮细胞生长的影响
• 3.5 双向电泳和质谱分析
• 3.5.1 pH 3-10 范围分析
• 3.5.2 pH 4-7 范围分析
• 3.6 亚细胞定位分析
• 3.6.1 相关载体构建
• 3.6.2 亚细胞定位观察
• 3.7 RNA水平表达分析
• 3.8 单向电泳和LC/MS-MS分析胞外介质蛋白
• 4 讨论
• 4.1 水稻悬浮培养细胞分泌蛋白的提取
• 4.2 质外体蛋白促进悬浮细胞增殖
• 4.3 双向电泳分离差异蛋白
• 4.4 亚细胞定位和RNA表达的分析
• 4.5 通过LC/MS-MS分析胞外介质蛋白
• 二 OsCP 和 OsCPI 的功能研究
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2 农杆菌的转化及鉴定
• 2.3 水稻组织培养和遗传转化
• 2.4 Southern Blot检测转基因植株T-DNA插入情况
• 2.5 悬浮系细胞鲜重和干重的测定
• 2.6 OsCPI重组蛋白的诱导表达
• 2.7 OsCPI的纯化
• 2.8 OsCPI的活性测定
• 2.9 纯化的OsCPI处理野生型水稻悬浮系
• 3 实验结果
• 3.1 OsCP和OsCPI结构与功能预测及分析
• 3.2 OsCP和OsCPI的组织表达分析
• 3.3 OsCP的功能分析
• 3.3.1 基因克隆载体构建
• 3.3.2 转基因鉴定
• 3.3.3 RNAi悬浮系表型观察
• 3.3.4 OsCP过表达植株表型观察
• 3.4 OsCPI的功能分析
• 3.4.1 OsCPI 转基因载体构建及鉴定
• 3.4.2 OsCPI的蛋白表达
• 3.4.3 纯化蛋白OsCPI的抑制活性
• 3.4.4 纯化蛋白OsCPI对悬浮细胞生长的影响
• 3.5 OsCP和OsCPI不能直接相互作用
• 4 讨论
• 4.1 OsCP的功能分析
• 4.2 OsCPI的功能分析
• 4.3 OsCP和OsCPI是否调节相同途径
• 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢