大米草SaVP1基因的克隆与表达研究

论文摘要

非生物胁迫，尤其是盐胁迫是作物减产的主要原因。近年来研究表明Na+/H+逆向转运蛋白在应对盐胁迫上具有重要作用，液泡膜上的H+-PPase质子泵为Na+/H+逆向转运蛋白提供H+驱动力。因此，克隆H+-PPase质子泵基因并转入植物体内可提高植物的耐盐能力。本文选择盐生植物大米草作为材料，进行大米草的H+-PPase基因SaVP1克隆，并进行生物信息学分析和烟草转基因耐盐试验，获得如下主要结果。1.利用RACE技术，从大米草中克隆了H+-PPase基因SaVP1。SaVP1序列全长2506bp，共编码667个氨基酸。2.生物信息学分析表明，SaVP1的核苷酸序列及其推到出的氨基酸序列与其他植物的液泡膜H+-PPase基因有一定的相似性。其核苷酸序列和氨基酸序列与卡拉草（Leptochloa fusca） LfVP1基因的同源性分别为94%和99%。3.构建SaVP1基因植物表达载体pCAMBIA1301-SaVP1，利用农杆菌介导法转化烟草，对转基因烟草苗进行PCR检测，获得了阳性转基因株。4.对5个转基因烟草株系进行盐分的耐受性试验结果显示，在300mMNaCl浓度胁迫下，4个转基因烟草株系仍能正常生长，但在400mMNaCl浓度下全部死亡；而野生型烟草在200mMNaCl浓度胁迫下不能正常生长，表明SaVP1转基因株能提高烟草耐盐性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 盐胁迫对植物的影响
• 1.1.1 盐胁迫对种子萌发和出苗的影响
• 1.1.2 盐胁迫对植物生长发育的影响
• 1.1.3 盐胁迫对植物光合作用的影响
• 1.1.4 盐胁迫对植物呼吸作用的影响
• 1.1.5 盐胁迫对植物蛋白合成的影响
• 1.1.6 盐胁迫下活性氧对植物的影响
• 1.1.7 盐胁迫下离子对植物的毒害
• 1.2 植物的耐盐机理
• 1.2.1 渗透调节
• 1.2.2 Na+的吸收和转运
• 1.2.3 大分子蛋白的积累
• 1.2.4 激素调节
• +-PPase 研究进展'>1.3 液泡膜 H⁺-PPase 研究进展
• +-PPase 的特性及结构'>1.3.1 液泡膜 H⁺-PPase 的特性及结构
• +-PPase 蛋白的特性及结构'>1.3.2 液泡膜 H⁺-PPase 蛋白的特性及结构
• +-PPase 的主要功能'>1.3.3 液泡膜 H⁺-PPase 的主要功能
• +-PPase 与耐盐的关系'>1.3.4 液泡膜 H⁺-PPase 与耐盐的关系
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 引物
• 3.1.5 培养基
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 大米草 RNA 的提取及 RNA 质量检测
• 3.2.2 大米草 SaVP1 基因片段的获得
• 3.2.3 大米草 SaVP1 基因全长的扩增
• 3.2.4 对获得的目的基因的生物信息学分析
• 3.2.5 植物表达载体 pCAMBIA1301-SaVP1 的构建
• 3.2.6 重组体 pCAMBIA1301-SaVP1 转化根癌农杆菌
• 3.2.7 叶盘法转化烟草
• 3.2.8 转基因烟草苗的 PCR 检测
• 3.2.9 转基因烟草苗对盐分的耐受性分析
• 4. 试验结果与分析
• 4.1 大米草 RNA 的鉴定
• 4.2 大米草 SaVP1 基因中间片段的 RT-PCR 扩增
• 4.3 大米草 SaVP1 全长的扩增
• 4.3.1 5’RACE 的扩增
• 4.3.2 3’RACE 的扩增
• 4.3.3 大米草 SaVP1 全长的克隆
• 4.4 大米草 SaVP1 基因全长的生物信息学分析
• 4.4.1 大米草 SaVP1 蛋白二级结构的分析
• 4.4.2 大米草 SaVP1 蛋白疏水性和亲水性分析
• 4.4.3 大米草 SaVP1 跨膜结构分析
• 4.4.4 大米草 SaVP1 信号肽分析
• 4.4.5 大米草 SaVP1 蛋白系统发育分析
• 4.5 植物表达载体 pCAMBIA1301-SaVP1 的构建
• 4.6 叶盘法转化烟草
• 4.6.1 共培养
• 4.6.2 诱导生芽
• 4.6.3 诱导生根
• 4.6.4 移栽
• 4.7 PCR 检测
• 4.8 转基因烟草苗对盐分的耐受性分析
• 5. 讨论
• 5.1 大米草 SaVP1 基因的分离
• 5.2 转基因烟草对盐分的耐受性分析
• 6. 结论及展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间获得成果