胃癌人源性ScFv噬菌体单链体库的构建和初步鉴定

论文摘要

背景：胃癌（Gastric Cancer）是全球常见肿瘤,全世界每年约有93.4万胃癌新发病例,有70万人死于胃癌,发病率居常见肿瘤第四位。在我国,胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡率的23.02%,居各类癌症死亡率首位。现阶段,胃癌的诊断方法以X线和内镜超声等为主,这对胃癌的早期诊断尚缺乏足够的准确性和特异性,在治疗方面,以放疗、化疗和手术治疗为主的综合治疗也因其副作用太大使其在临床中的应用受到了很多限制。所以,许多研究者把研究热点转向了胃癌的抗体诊断和治疗,这对胃癌的防治将具有重要的意义。抗体技术的应用对医学发展起了非常重要的推动作用,被广泛地应用于实验室研究、疾病的诊断和治疗,其在疾病诊断、治疗和预防等方面显示出了重要作用。噬菌体抗体库（Phage Antibody Library）的构建以聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和噬菌体展示（Phage Display Techniques, PDT）技术为基础,通过构建人源性单链噬菌体抗体库为获得特异性抗体分子提供有效途径。这不仅是一种制备人源性抗体的有效方法,而且能够制备出具有大容量和多样性较好的抗体库,在获得高亲和力的抗体以及在对抗体性能进行改造方面具有强大的优势。噬菌体抗体技术的出现和发展使研究者能够在体外模拟体内B细胞产生抗体的整个过程,为人源抗体的制备提供了简便而高效的可操作系统,因而在多种疾病的预防、诊断和治疗方面均具有重要的理论意义和应用前景。目的：利用基因工程方法和噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术,构建胃癌人源性ScFv噬菌体单链抗体库,并初步鉴定其生物学特性,为胃癌的免疫诊断和免疫治疗提供新载体。方法：1.取原发性胃癌患者癌周转移淋巴结作为B细胞的来源,提取淋巴细胞的总RNA,利用逆转录PCR（Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）技术扩增抗体重链可变区（VH）和抗体轻链可变区（VL）基因片段,对VH、VL基因片段分别进行酶切和凝胶回收纯化；合成Linker连接肽,连接VL+Linker,再连VH形成VH-Linker-VL,然后,在抗体基因片段的两端引入酶切位点Sfi I和Not I,最后利用“重叠延伸拼接PCR（Splicing by Overlap Extension Polymerase Chain Reaction, SOE-PCR）"技术将其拼接成完整的单链抗体（ScFv）基因片段。2.噬菌体单链抗体（ScFv）与载体pCANTAB-5E拼接,构建抗体库：单链抗体ScFv基因片段用限制性内切酶Sfi I, Not I分步酶切后,凝胶回收纯化酶切产物并通过连接反应将单链抗体ScFv与载体pCANTAB-5E连接,制备转化效率达到6.0×107cfu/ug pUC的高浓度感受态大肠杆菌TGl,将插入单链抗体ScFv的噬菌体载体pCANTAB-5E转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染,噬菌体展示即可制备出单链噬菌体ScFv抗体库,对抗体库的库容量与重组率进行检测。结果：1.结果显示：从胃癌癌周转移淋巴结中提取的总RNA在琼脂糖凝胶电泳结果中可见明显的28S和18S两条带,提示RNA的完整性良好；重链VH基因片段的大小为375bp,轻链VL基因片段的大小为325bp；组装后的ScFv基因片段（VH-Linker-VL） PCR扩增显示长度为750bp。2.获得4.7×107cfu/ug氨苄青霉素抗性克隆。以适量转化细菌菌液铺平板,随机提取10个克隆,小提载体质粒DNA后以Sfi I和Not I分步酶切鉴定,阳性插入率为80%（8/10）。经测序证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确插入了载体,同源性为91%。结论：本实验成功构建了库容量为4.7×107cfu/ug的ScFv噬菌体抗体库,重组率为80%（8/10）,重链可变区和轻链可变区基因序列同源性为91%。结果表明通过噬菌体抗体库技术（Phage Antibody Library Technology）可以直接从肿瘤病人的癌周转移淋巴结中获得肿瘤相关的完全人源的基因片段,为今后制备各种抗体提供了技术平台和思路,希望为后续的特异性抗体筛选研究提供技术和物质支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 图表索引
• 中英文缩略词
• 引言
• 材料与方法
• 1 实验材料和仪器设备
• 1.1 标本采集
• 1.2 菌株与载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 主要溶液配制
• 1.6 引物和连接肽Linker的设计
• 2 实验方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 淋巴细胞总RNA的抽提
• 2.3 逆转录（RT-PCR）扩增cDNA
• 2.4 重链和轻链PCR产物DNA片段凝胶回收
• 2.5 Linker连接肽的合成和酶促磷酸化粘端
• H+Linker+V_L的制备'>2.6 V_H+Linker+V_L的制备
• 2.7 制备载体质粒DNA
• 2.8 单链抗体基因库（ScFv）与噬菌粒载体pCANTAB-5E拼接
• 2.9 制备感受态大肠杆菌TG1
• 2.10 辅助噬菌体的制备
• 2.11 噬菌体的滴定
• 2.12 转化感受态大肠杆菌TG1和构建ScFv单链噬菌体抗体库
• 2.13 重组质粒的特异PCR鉴定
• 2.14 重组质粒的酶切鉴定和保存
• 2.15 阳性克隆基因序列测定
• 2.16 序列的比较分析
• 结果与分析
• 1 原发性胃癌患者癌周转移淋巴结总RNA的提取
• 2 RT-PCR扩增抗体轻链、重链基因片段
• H和V_L基因片段的扩增'>3 V_H和V_L基因片段的扩增
• 4 ScFv基因的组装与扩增
• 5 ScFv噬菌体单链抗体库的构建
• 6 阳性克隆质粒PCR扩增鉴定
• 7 阳性重组质粒的双酶切鉴定
• 8 酶切阳性质粒测序结果
• 讨论
• 1 单链抗体及其多样性
• 2 噬菌体抗体库库容量的增加
• 3 噬菌体展示抗体库技术
• 结论
• 参考文献（Reference）
• 综述 单链抗体在肿瘤诊治中的应用及研究进展
• 1 基因工程抗体
• 2 噬菌体抗体库技术
• 3 单链抗体的研究进展和在临床诊治中的应用
• 4 单链抗体（ScFv）与肿瘤诊治
• 5 单链抗体与胃癌的免疫基因治疗
• 6 应用及其展望
• 参考文献（Reference）
• 附录 载体pCANTAB-5E
• 个人简历、在学期间发表的学术论文
• 致谢