论文题目: 棉铃虫个体发育过程中组织蛋白酶B的表达及功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 杨晓梅
导师: 赵小凡
关键词: 棉铃虫,个体发育,变态,组织蛋白酶,酶活性,脂肪体,血细胞
文献来源: 山东大学
发表年度: 2005
论文摘要: 蛋白水解酶(protease)是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称,简称蛋白酶。广泛分布于动物、植物及微生物中,种类繁多。蛋白酶对机体的新陈代谢及生物调控具有重要作用。蛋白酶按水解肽链的部位可分为内肽酶(EC3.4 21-24,99)及外肽酶(EC3.4 11-19)。根据各种内肽酶作用位点的催化基团又可将之分为四大类,分别为丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶,天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 组织蛋白酶(cathepsin,cath.)是一大类对有机体的生命活动非常重要的蛋白酶。组织蛋白酶通常指在酸性环境中被活化的蛋白水解酶。正常状态下,组织蛋白酶位于溶酶体,并可非特异性水解多种蛋白质提供有机体需要的氨基酸和能量。还可以参与有机体的其他生理活动。如骨质吸收和细胞凋亡等。如果组织蛋白酶异常表达,它们也可以引起病理反应。如通过降解细胞外基质蛋白,加速肿瘤细胞的迁移和扩散。 组织蛋白酶通常以无活性的酶原形式和有活性的成熟酶形式存在,酶原因包含一个前导肽序列而没有活性。酶原活化是调节组织蛋白酶活性的一个关键步骤,方式包括前导肽从组织蛋白酶上自动解离即自我活化,或者是依赖于其他蛋白酶的加工作用。组织蛋白酶的活性还可以受到抑制剂的调节,通常组织蛋白酶都具有相应的抑制剂。 在昆虫中也有大量的组织蛋白酶分布,其中常见的为Cath.B、Cath.D和Cath.L。表达和分布部位多见于脂肪体组织、幼虫的消化道、早期胚胎以及卵母细胞等。功能与昆虫的卵母细胞发生、早期胚胎发育、食物消化以及变态过程中组织的解体和重建有关。 棉铃虫(Helicoverpa armigera)属鳞翅目夜蛾科,是一种分布广泛、危害严重的农业害虫。本实验室已从棉铃虫卵中鉴定并纯化出棉铃虫组织蛋白酶B(H. armigera cathepsin B, HCB, EC 3.4.22.1),并克隆了该酶的全长cDNA(GenBank AF222788)。HCB属于半胱氨酸类蛋白酶,酶原的分子量约为37kDa,成熟酶的分子量约为30kDa。该酶的最适pH为3.0-4.0,活性可以被半胱氨酸蛋白酶抑制剂反-环氧琥珀酰-L-白氨酰-(4-胍基)-丁烷(E-64)抑制。在此基础上,还在体外进行了HCB的表达研究,并进行了该酶的底物特异性和组织分布研究,已证实该酶参与了棉铃虫胚胎发育过程中卵黄蛋白水解等生命活动。
论文目录:
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英文摘要
缩写
第一章 前言
1．1 组织蛋白酶概述
1．1．1 蛋白酶的性质和分类
1．1．2 组织蛋白酶的结构和特性
1．1．3 组织蛋白酶抑制剂
1．1．4 组织蛋白酶的合成加工与表达调控
1．1．5 组织蛋白酶的分布和生理功能
1．1．6 组织蛋白酶与人类疾病
1．1．7 组织蛋白酶与细胞凋亡
1．2 昆虫组织蛋白酶研究
1．2．1 昆虫组织蛋白酶的合成部位与组织分布
1．2．2 组织蛋白酶与昆虫个体发育调控研究
1．3 棉铃虫组织蛋白酶研究
1．3．1 棉铃虫组织蛋白酶B研究进展
1．3．2 本研究的目的和意义
1．3．3 研究展望
参考文献
第二章 棉铃虫组织蛋白酶B的单克隆抗体制备
2．1 实验材料
2．1．1 动物和细胞
2．1．2 试剂
2．1．3 仪器
2．1．4 主要溶液
2．2 实验方法
2．2．1 抗原制备
2．2．2 动物免疫和检测
2．2．3 单克隆抗体制备
2．2．4 单克隆抗体检测
2．3 实验结果
2．3．1 抗原HCB的制备
2．3．2 免疫小鼠多克隆抗血清检测
2．3．3 阳性杂交瘤细胞株的建立
2．3．4 抗HCB的单克隆抗体鉴定
2．4 讨论
参考文献
第三章 棉铃虫个体发育过程中组织蛋白酶B表达研究
3．1 试剂材料
3．1．1 试剂
3．1．2 仪器
3．1．3 主要溶液
3．2 实验方法
3．2．1 棉铃虫饲养及发育观察
3．2．2 组织匀浆液制备及蛋白质含量测定
3．2．3 原位水解电泳进行组织中HCB活性分析
3．2．4 Western blotting法分析HCB的组织分布
3．2．5 石蜡包埋组织切片的制备
3．2．6 免疫组织化学法分析HCB的组织定位
3．2．7 棉铃虫组织总RNA提取及检测
3．2．8 Northern blotting
3．3 结果
3．3．1 HCB在棉铃虫个体发育过程中的表达和活性
3．3．2 HCB在各发育时期棉铃虫组织的表达调控
3．3．3 HCB在棉铃虫组织中的分布
3．4 讨论
参考文献
第四章 棉铃虫血细胞分类及HCB在血细胞中的表达
4．1 试剂材料
4．1．1 试剂
4．1．2 仪器
4．1．3 主要溶液
4．2 实验方法
4．2．1 棉铃虫饲养
4．2．2 血细胞匀浆液制备及蛋白质含量测定
4．2．3 Western blotting法分析HCB在血细胞中的表达
4．2．4 棉铃虫血细胞分类
4．2．5 免疫细胞化学法检测棉铃虫血细胞中HCB的表达和分布
4．2．6 原位杂交法检测棉铃虫血细胞中HCB的表达
4．3 结果
4．3．1 棉铃虫血细胞的分类和特征
4．3．2 HCB在棉铃虫血细胞中转录和翻译的定位
4．3．3 HCB在棉铃虫幼虫和蛹血细胞中的表达
4．4 讨论
参考文献
第五章 棉铃虫组织蛋白酶B活性变化调控机理研究
5．1 试剂材料
5．1．1 试剂
5．1．2 仪器
5．1．3 主要溶液
5．2 实验方法
5．2．1 棉铃虫饲养及发育观察
5．2．2 组织匀浆液制备及蛋白质含量测定
5．2．3 原位水解电泳对组织进行HCB活性分析
5．2．4 棉铃虫组织总RNA提取及检测
5．2．5 Northern blotting
5．2．6 成虫脂肪体基因组DNA提取和DNA ladder检测
5．2．7 脂肪体组织的光学显微镜观察
5．2．8 电子显微镜观察雌性成虫脂肪体
5．2．9 RH-2485对HCB活性的影响
5．2．10 E-64对HCB活性的抑制
5．3 结果
5．3．1 HHR3和RH-2485对HCB活性的调控
5．3．2 雌性成虫脂肪体降解与HCB的活化
5．4 讨论
参考文献
结论及创新点
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
发布时间: 2006-05-30
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