小鼠干细胞因子的大肠杆菌表达、纯化及活性测定

论文摘要

干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）又称为肥大细胞生长因子、c-kit配体。天然SCF是分子量约为18. 5KD的酸性糖蛋白,它是由骨髓基质细胞产生。其与c-kit的结合,可调节造血干细胞、肥大细胞、黑色素细胞和生殖细胞和增殖,生长、分化和移行等生理功能。该因子可用于治疗贫血,并在骨髓移植、基因治疗、体外造血干细胞培养,干细胞移植和抗辐射损伤等工作中有广泛应用。在种属特异性方面,人和小鼠的SCF的同源性达83%。虽然人SCF对小鼠造血干细胞的增殖影响不大,但小鼠SCF（mSCF）对人造血干细胞的作用却与人SCF相似。天然的SCF主要由山骨髓基质细胞产生,来源少,难以大规模纯化。但是由于SCF的生物学活性不依赖于糖基化,因此原核表达系统是一种提供大量SCF的有效手段本研究取发育至十天左右的小鼠胚胎,研碎后提取总RNA,采用 RT-PCR方法从小鼠胚胎总RNA中获得小鼠SCF的cDNA,并克隆入pGEM-T内成pGEM-T-SCF。用BamHI和Xhol将mSCF cDNA从pGEM-T-SCF内切出并克隆入pGEX-4T-3内谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游成表达质粒pGEX-4T-3-SCF,将pGEX-4T-3-SCF转化大肠杆菌BL21后,在0. 5mMTPTG和35℃条件下诱导表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGF）后,确定为预期的53KD的融合表达条带,用山羊抗GST抗体进行Western-blot试验,结果确证了融合蛋白的表达。诱导H.菌液,细菌经超声破碎后离心取上清,通过 GlutathioneSepharose-4B亲和吸附融合形式的重组小鼠干细胞因子（rmSCF）,用凝血酶在柱上直接酶切,最后用5倍柱体积的PBS将rmSCF洗下,结果获得纯度约为80%的rmSCF,rmSCF为27KD。由于获得的rmSCF中含有一定量的GST和其它杂蛋白（部分是融合形式的GST-rmSCF）,将rmSCF重新进行(Glutathione Sepharose-4B亲和层析以去除其中的GST和GST-rmSCF蛋白,经5次亲合后rmSCF的纯度可达85%。为了进一步提高纯度,用Q-Sepharose柱对亲合纯化获得的rmSCF进行了离子交换层析,平衡液为10mmol/LTris-HCL,pH7. 2,梯度洗脱液为10mmol/LTris-HCL,pH7. 2和1 mol/LNaCL。经梯度洗脱,当盐浓度在0. 36mol/L时可将rmSCF洗脱下来,紧接着分别用截留分子量为10000D和30000D的超膜膜对离子交换层析后获得的rmSCF进行超滤,这样下来,rmSCF的纯度可达90%以上。用rmSCF协同rhGM-CSF刺激人骨髓细胞集落形成的方法检测rmSCF的活性,结果表明,当分别用50 ng/ml,100 ng/ml及200 ng/ml的rmSCF的协同作用的

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献综述
• 第一部分 小鼠干细胞因子基因的克隆与表达
• 第二部分 重组小鼠干细胞因子（rmSCF）表达最佳条件的探索
• 第三部分 重组小鼠干细胞因子（rmSCF）的分离纯化
• 第四部分 重组小鼠干细胞因子（rmSCF）的活性测定
• 研究成果
• 附录
• 参考文献
• 致谢