pf40基因产物的亚细胞定位以及其功能研究

论文题目: pf40基因产物的亚细胞定位以及其功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 夏玉凤

导师: 敖光明

关键词: 绿色荧光蛋白,定位,内质网,分枝,顶端优势

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物的顶端优势是顶芽完全或部分抑制侧芽生长的现象。植物的分枝和株型在很大程度上受到顶端优势的影响。随着分子生物学的发展,人们有机会应用转基因植物和突变体从不同角度对顶端优势作用机理进行深入研究。 pf40是从谷子未成熟种子cDNA文库中得到的一个克隆。在GenBank中进行blast比对,发现其与编码离子通道蛋白及一些内膜蛋白基因的核酸序列相似性很高,并且蛋白产物的氨基酸序列也很相似。不仅如此,PF40与离子通道蛋白ZIP家族在跨膜拓扑结构上极其相似。由于PF40与ZIP家族在一级结构和高级结构上均非常相似,推测PF40可能属于ZIP家族。 PSORT软件预测PF40可能定位在内膜系统,具有跨膜区域,N端有信号肽序列。为了确定PF40的亚细胞定位,构建了含pf40与报告基因gfp的融合基因的表达载体,由农杆菌介导转化烟草,PCR、Southern杂交证明外源基因整合到基因组中。用荧光显微镜观察,发现PF40的亚细胞定位是在围绕核的内质网以及胞质网格状内质网上。免疫胶体金标记实验进一步证明PF40定位在内质网。 为了确定PF40的内质网定位区段,构建了pf40的4个不同长度的缺失片段(f12、f14、f56、f36)与报告基因gfp连接的植物表达载体,由农杆菌介导转化烟草。用Confocal及荧光显微镜观察,发现N端缺失造成蛋白不能正确定位到内质网上;而N端93个氨基酸的PF40片段与GFP形成的融合蛋白F12-GFP(包含跨膜区1-3)及N端187个氨基酸的PF40片段与GFP形成的融合蛋白F14-GFP(包含跨膜区1-5)的荧光主要存在于内质网,表明PF40的内质网定位信号存在于蛋白的N端,而C端缺失对其定位没有影响,N端93个氨基酸能够引导蛋白定位在内质网。 在获得的转PBI-PF40-GFP的烟草中,只有检测到荧光的烟草才发生表型改变,在营养生长时期,植株基部出现分枝;而未检测到荧光的烟草均未出现分枝。不同植株中基因整合位置不同,各植株是由不同的转化事件产生的。作为对照的转pBI-GFP的烟草,其表型与未转基因的烟草表型一致,只有一个主茎,未出现分枝。pf40基因的表达,可能是引起烟草表型变化的原因。PF40蛋白的C-端与GFP融合后未影响pf40基因功能。 将两个植物表达载体pBI-PF40S(含pf40正义基因)和pBI-PF40AN(含pf40反义基因)用浸泡法转化拟南芥,得到转基因植株。PCR、Southern杂交证明外源基因已经遗传至下一代。转pf40正义基因的拟南芥,出现分枝的时期比野生型早,而且主要在植株基部出现分枝并且分枝数量比野生型多;转pf40反义基因的拟南芥与野生型相比,表型差异不明显。 转pf40正义基因的拟南芥与未转基因的拟南芥相比,其生长素水平明显降低,而细胞分裂素水平增高不显著,IAA/ZR比值明显降低。由此推测PF40可能是通过影响激素的量而影响转基因植物的表型。转反义基因的拟南芥与未转基因的拟南芥相比,其激素的量变化不明显,表型也与未转基因的拟南芥差异不明显。检测还发现两种转基因植物的根对IAA的敏感性没有变化。 克隆了生长素合成途径两个关键酶基因:asb(邻氨基苯甲酸合成酶β亚基基因),tsb(色氨酸合成酶β亚基基因)。检测拟南芥的AS、TSβ酶活性,发现转pf40正义基因的AS酶活性明显降低,TSβ酶活性没有改变;转反义基因的拟南芥与未转基因的拟南芥相比,AS、TSβ酶活

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词

第一章 文献综述

1.1 影响植物顶端优势及分枝的因素

1.1.1 顶端优势分子机制研究进展

1.1.2 几种影响植物分枝的基因及其突变体

1.2 蛋白的亚细胞定位研究

1.2.1 定位信号

1.2.2 研究蛋白亚细胞定位主要的几种方法

1.3 定位于内质网的一些蛋白

1.3.1 生长素受体ABP1

1.3.2 拟南芥的乙烯受体ETR1

1.3.3 乙烯反应的负调节因子CTR1

1.3.4 某些离子通道蛋白

1.4 选题意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 常用培养基和溶液的配制

2.3 实验所需试剂配制

2.4实验方法

第三章 实验结果与分析

3.1 PF40蛋白亚细胞定位研究

3.1.1 pf40基因及其蛋白产物特征

3.1.2 软件分析PF40亚细胞定位

3.1.3 PF40的亚细胞定位研究

3.2 pf40基因功能研究

3.2.1 pf40基因转化拟南芥

3.2.2 转基因拟南芥的分子检测及表型

3.2.3 转基因拟南芥的生长素和细胞分裂素含量测定

3.2.4 转基因对生长素合成途径中的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)及色氨酸合成酶(TSβ)的基因的影响

第四章 讨论

4.1 PF40蛋白亚细胞定位标记分子的选择

4.2 PF40蛋白的定位信号分析

4.3 PF40蛋白对植物分枝的影响

4.4 PF40蛋白的作用模式预测

第五章 结论

论文的创新性

参考文献

附录：常用生物信息数据库网址

致谢

简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

• [1].植物基因安全转化体系关键技术的研究[D]. 袁媛.中国农业大学2005
• [2].天花粉蛋白基因表达载体的构建及转化杨树的研究[D]. 邹莉.东北林业大学2005
• [3].干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究[D]. 樊正球.复旦大学2004
• [4].药用多肽基因植物表达载体的构建及其对胡萝卜和番茄的遗传转化[D]. 张丽华.西北农林科技大学2002
• [5].香鳞毛蕨中黄酮代谢途径关键酶基因的克隆与功能验证[D]. 孙莉莉.东北农业大学2015
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• [7].双生病毒外壳蛋白和传毒相关蛋白基因介导的病毒抗性研究[D]. 唐前君.湖南农业大学2010
• [8].海州香薷不同种群酸性转化酶基因的克隆与表达研究[D]. 蔡深文.武汉大学2013
• [9].大豆黄酮合成酶基因的克隆与RNA干扰调控异黄酮含量的研究[D]. 姜伊娜.上海交通大学2013
• [10].农杆菌介导转Bt cry1Ah和cry1Ie基因抗虫植物的研究[D]. 李秀影.东北农业大学2013

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