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水貂体重、皮长性状相关基因研究及自咬症病因分子遗传分析

2020-11-28阅读(944)

水貂体重、皮长性状相关基因研究及自咬症病因分子遗传分析

论文摘要

水貂是小型珍贵毛皮兽,水貂皮、狐皮和波斯羔皮早已成为国际裘皮贸易的三大支柱产品。当前,水貂产业正面临着良好的发展机遇和前景,因此,提高水貂的生长性能,将给水貂养殖业带来更高的经济效益。本研究以大兴安岭水貂养殖基地饲养的水貂（643只）作为研究对象,针对IGF-Ⅰ基因、GH基因、EGF基因、MSTN基因进行研究,采用克隆测序结合PCR-SSCP标记的方法,检测了这些基因部分编码区的SNPs,并分析了突变位点导致的多态性与体重和皮长性状之间的相关性。为利用与生长性状相关的标记基因进行标记辅助选择打下基础;为水貂品种的选育、提高水貂生长速度、皮张质量提供分子水平的手段和方法。同时,本研究还以大连金州水貂场的自咬水貂和健康水貂作为研究对象,采用RAPD标记技术结合SCAR标记技术对正常水貂样本（30只）和自咬水貂样本（30只）分别进行了分子水平的遗传结构分析。对各样本中出现的显著RAPD差异标记经克隆测序后,采用SCAR标记对采集的全部样本进行PCR扩增,以扩增产物中标记片段的出现与否来区分健康水貂与自咬水貂个体。此研究为今后水貂的抗病育种或免疫育种奠定了基础,如果与传统的育种技术相结合,可以进一步改良水貂品种,提高养貂业的生产效益,推动我国特种经济动物养殖的发展速度。主要研究结果如下:（1）成功克隆了水貂的GH基因的部分DNA序列,得到了1060bp的序列。从序列比较中可知该片段存在三个突变位点（分别在第269、538和539位点处）。（2）在检验的2对GH基因的引物中,我们发现2对引物的扩增片段均具有多态性。引物GH1扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现3种基因型（命名为AA、BB、AB）。BB基因型个体体重及皮长均显著高于AA基因型和AB基因型个体（P<0.05）,因此可以初步判定B基因可能对水貂生长有利。引物GH2扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现3种基因型（命名为CC、CD、DD）;三种基因型个体对水貂体重、皮长性状的影响均未达到显著水平（P>0.05）。（3）在检测的3对IGF-Ⅰ基因的引物中,我们发现2对引物的扩增片段具有多态性。引物IGF-Ⅰ1扩增片段多态性经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现2种基因型（命名为AA、AB）。A等位基因出现的频率在整个检测群体中显著高于B等位基因。但统计结果显示,AB基因型个体体重及皮长均极显著高于AA基因型个体（P<0.01）,因此初步判定B等位基因是优势基因。引物IGF-Ⅰ2扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现3种基因型（命名为CC、CD、DD）。三种基因型个体对水貂体重、皮长性状的影响均未达到显著水平（P>0.05）。引物IGF-Ⅰ3扩增产物经PCR-SSCP检测没有出现多态。（4）成功克隆了水貂的EGF基因的部分外显子DNA序列,得到了1002bp的序列。经同源性比较得出与小家鼠的EGF基因的同源性达到94%;与褐鼠EGF基因同源性达83%;与猕猴的EGF基因同源性为79%;与人类的EGF基因同源性为78%。从序列比较中可知该片段存在三个突变位点（分别在45、196和498位点处）。在3个突变位点两端设计引物,经PCR-SSCP检测,有2对引物扩增片段出现了多态。引物EGF1扩增片段经PCR-SSCP检测,出现3种基因型（命名为AA、AB、BB）。B等位基因出现的频率在整个检测群体中高于A等位基因。统计结果显示,BB基因型个体体重及皮长均显著高于AA基因型个体（P<0.05）,AB型个体体重也显著高于AA型个体（P<0.05）,AB型个体皮长与AA、BB型个体差异均不显著（P>0.05）。因此可以初步判定B等位基因可能是优势基因。引物EGF2扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现3种基因型（命名为CC、CD、DD）。三种基因型个体对水貂体重的效应统计结果显示均未达到显著水平（P>0.05）。对皮长性状影响,CD型个体显著高于CC型（P<0.05）,二者和DD型个体均没有显著差异（P>0.05）。引物EGF3扩增产物经PCR-SSCP检测没有出现多态。（5）成功克隆了水貂的MSTN基因的外显子DNA序列,得到了1128bp的序列。经同源性比较得出与犬的MSTN基因的同源性达到94%;与狐的MSTN基因同源性达93%;与小鼠同源性为85%;与野猪的MSTN基因同源性为94%;与牛的MSTN基因同源性为86%;与人类的MSTN基因同源性为93%。从序列比较中可知该片段存在四个突变位点（分别在第186、380、616及648位点处）。在4个突变位点两端设计引物,经PCR-SSCP检测,3对引物扩增片段均出现了多态。引物MSTN1扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现3种基因型（命名为AA、AB、BB）。A等位基因出现的频率在整个检测群体中高于B等位基因。统计结果显示,BB基因型个体体重及皮长均显著高于AA基因型个体（P<0.05）,AB型个体体重显著高于AA型个体（P<0.05）,AB型个体体重和BB型个体差异不显著（P>0.05）,AB型个体皮长与AA、BB型个体差异均不显著。因此初步推测B等位基因可能是优势基因。引物MSTN2扩增片段经PCR-SSCP检测,在水貂群体中出现2种基因型（命名为CC、CD）。C等位基因出现的频率在整个检测群体中高于D等位基因。统计结果显示,CD型个体体重及皮长均显著高于CC型个体（P<0.05）,推测D基因可能是优势基因。引物MSTN3扩增产物经PCR-SSCP检测出现3种基因型（命名为EE、EF、FF）。E等位基因出现的频率在整个检测群体中高于F等位基因。统计结果显示,FF型个体体重及皮长均显著高于EE型个体（P<0.05）,推测F基因可能是优势基因。统计各基因型之间的组合给水貂体重及皮长性状带来的影响时,发现四种基因不同基因型之间的组合对所检测的水貂样本的体重及皮长差异显著（P<0.05）。（6）采用RAPD标记和SCAR标记技术对水貂的自咬症发病原因进行遗传分析时,100条随机引物中,筛选出26条产生清晰、稳定扩增产物的引物,其中18条引物出现多态性,多态率为26.67%。筛选出的26条随机引物,在水貂健康组与患病组以相同条件进行了3次重复扩增。扩增结果显示,有11条引物扩增的结果重复性较好、多态片段明显（分别是S103,S112,S120,S139,S144, S167,S176,S178,S356,S358,S360）。其中引物S103和S356扩增的条带共性与差异标记最明显,针对其扩增出的不同标记片段,将其回收、克隆、测序,获得了标记片段的特定序列。并对标记片段进行序列分析,重新设计4对引物,将RAPD标记成功转化成SCAR标记,在水貂的健康组与患病组个体中分别验证。结果表明水貂的自咬症发病原因与遗传基因相关,利用RAPD标记结合SCAR标记能够区分健康与自咬水貂群体。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  • 1.1 水貂研究背景及发展概况
  • 1.1.1 水貂生产发展概况
  • 1.1.2 水貂品种及分布
  • 1.1.3 水貂的药用与经济价值
  • 1.1.4 我国养貂业现状
  • 1.1.5 水貂养殖的前景与展望
  • 1.1.6 水貂在分子遗传水平上的研究进展
  • 1.2 遗传标记的研究概述
  • 1.2.1 RAPD 标记
  • 1.2.2 SCAR 标记
  • 1.2.3 PCR- SSCP 标记
  • 1.3 四种候选基因的国内外研究进展
  • 1.3.1 生长激素（GH）基因研究进展
  • 1.3.2 类胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因的研究进展
  • 1.3.3 表皮生长因子（EGF）基因的研究进展
  • 1.3.4 肌肉生长抑制素（MSTN）基因的研究进展
  • 1.4 自咬症病因的研究概况及背景
  • 1.5 本研究的目标和内容
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 多态性分析所需试验样品的采集
  • 2.1.2 自咬症病因分析所用样本的采集
  • 2.1.3 资料收集
  • 2.1.4 主要仪器设备
  • 2.1.5 主要试剂及配制方法
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 全基因组DNA 提取
  • 2.2.2 基因组DNA 的浓度测定和质量检测
  • 2.2.3 候选基因序列的克隆与测序
  • 2.2.4 PCR-SSCP 检测多态
  • 2.2.5 尾分析法检测水貂自咬症的发病原因
  • 3 结果与分析
  • 3.1 基因组提取结果
  • 3.2 GH 基因
  • 3.2.1 GH 基因的克隆测序结果与分析
  • 3.2.2 GH 基因SNPs 的检测结果与分析
  • 3.2.3 水貂GH 基因多态性的等位基因频率和基因型分布频率
  • 3.2.4 水貂 GH 基因多态性与体重、皮长性状的相关分析
  • 3.2.5 GH 基因各基因型组合对体重及皮长性状的关联分析
  • 3.2.6 小结
  • 3.3 IGF-Ⅰ基因
  • 3.3.1 IGF-Ⅰ 1基因序列的 SNPs 分析
  • 3.3.2 IGF-Ⅰ2 基因序列的SNPs 分析
  • 3.3.3 水貂 IGF-Ⅰ基因多态性的等位基因频率和基因型分布频率
  • 3.3.4 水貂 IGF-Ⅰ基因多态性与体重性状的相关分析
  • 3.3.5 IGF-Ⅰ基因各基因型组合对体重及皮长性状的关联分析
  • 3.3.6 小结
  • 3.4 EGF 基因
  • 3.4.1 EGF 基因克隆与测序
  • 3.4.2 引物EGF1 扩增的EGF 基因序列的SNPs 分析
  • 3.4.3 引物 EGF2 扩增的基因序列的 SNPs 分析
  • 3.4.4 引物 EGF3 扩增的基因序列的 SNPs 分析
  • 3.4.5 水貂EGF 基因多态性的等位基因分布频率和基因型分布频率
  • 3.4.6 水貂 EGF 基因多态性与体重、皮长性状的相关分析
  • 3.4.7 EGF 基因各基因型组合对体重及皮长性状的关联分析
  • 3.4.8 小结
  • 3.5 MSTN 基因
  • 3.5.1 MSTN 基因的克隆与测序
  • 3.5.2 引物 MSTN1 扩增的 MSTN 基因序列的 SNPs 分析
  • 3.5.3 引物MSTN2 扩增序列的SNPs 分析
  • 3.5.4 引物MSTN3 扩增序列的SNPs 分析
  • 3.5.5 水貂MSTN 基因多态性等位基因分布频率和基因型分布频率
  • 3.5.6 水貂MSTN 基因多态性与体重、皮长性状的相关分析
  • 3.5.7 MSTN 基因各基因型组合对体重及皮长性状的关联分析
  • 3.5.8 四种基因与水貂体重及皮长性状的最小二乘分析
  • 3.5.9 小结
  • 3.6 RAPD标记结合SCAR标记检测水貂自咬症的发病原因
  • 3.6.1 DNA 的浓度与纯度的检测
  • 3.6.2 引物筛选结果
  • 3.6.3 筛选出的引物的重复性结果
  • 3.6.4 数据统计结果
  • 3.6.5 特异片断的测序结果与分析
  • 3.6.6 SCAR 特异引物的PCR 扩增结果
  • 3.6.7 小结
  • 4 讨论
  • 4.1 关于取样和样本容量
  • 4.2 GH 基因的多态性与水貂体重、皮长性状的相关性
  • 4.2.1 GH 基因的多态性对水貂体重性状的影响
  • 4.2.2 GH 基因的多态性对水貂皮长性状的影响
  • 4.2.3 GH 基因的多态性标记对水貂体重、皮长性状的影响
  • 4.3 IGF-Ⅰ基因的多态性与水貂体重、皮长性状的相关性分析
  • 4.4 水貂EGF 基因的多态性对水貂体重及皮长性状的影响
  • 4.5 水貂MSTN 基因的多态性对水貂体重及皮长性状的影响
  • 4.6 利用RAPD 标记和SCAR 标记进行自咬症病因遗传分析
  • 4.7 RAPD 标记和SCAR 标记
  • 4.8 PCR-SSCP 技术的影响
  • 4.9 存在的问题和有待进一步研究解决的问题
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

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