论文摘要
柿树炭疽病（Persimmon anthracnose）是由胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides Penz．）侵染造成的，在全世界产柿国家均有发生。近年来，随着浙江省淳安地区无核柿（Diospyros kaki cv．Wuheshi）的大面积栽种，柿树炭疽病趋于严重。本实验室已对病原菌、发病规律、致病机理及与寄主互作机制进行了系统研究，然而，许多工作仅局限在细胞学水平上。利用分子生物学技术分离和鉴定柿树炭疽菌的致病相关基因，是了解柿树炭疽菌致病机理及互作机制的重要手段，不仅在植物病理学上有重要意义，而且也为生产上进一步探索新的防病途径提供线索。因此，本文采用SuperCos1载体构建了基因组文库，同时用（Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation）ATMT技术进行了柿树炭疽菌的转化，并对致病性相关的基因进行了克隆。1基因组文库构建采用SuperCos1载体构建了胶孢炭疽菌基因组文库。建立了SDS及蛋白酶K提取高质量基因组DNA的方法，酶切可获得大小约40 kb DNA片段。片段被连接和包装后，转染XL1-Blue MR细菌，最终获得4．0×104个粘粒克隆（每微克基因组DNA约产生105个粘粒克隆）。它们混合在15％甘油中，保存于-70℃条件下。通过对50个随机重组子分析表明，98％的重组子克隆中含有外源DNA片段，平均大小为40．5 kb。按照胶孢炭疽菌基基因组DNA为50 Mb计算，库容量已高达31．75，理论上从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率高达99．9％。对扩增保存后文库菌液滴度测定显示，该文库滴度约为4．6×108cfu／ml。当进行3次反复冻融后，其滴度仍可达4．0×108cfu／ml。以上结果表明，构建的粘粒基因组文库质量比较高，符合筛选目的基因的要求。2农杆菌介导的柿树炭疽菌转化及突变体筛选本试验中，首先将构建的双元载体pATMT1通过电转化法导入农杆菌AGL-1中，然后AGL-1菌液与800μl的1×106／ml柿树炭疽菌TSG001分生孢子在乙酰丁香酮（AS）的培养基上共培养。经过两轮hyg抗性筛选后共获得787个转化子，转化效率高达900转化子／106个分生孢子。对随机挑选的14个转化子进行PCR验证表明，含有T-DNA的转化子比率达92．8％。通过表型分析，筛选出22个生长速度变异的转化子，30个菌落颜色变化的转化子，32个产孢能力减弱的转化子和18个孢子形态变异的转化子。通过致病性试验测定，获得5个弱致病性和6个无致病性转化子。3无致病性突变体分析生物学特性分析进一步对6个无致病性突变体进行分析，Cg-10、Cg-32、Cg-305、Cg-573、Cg-608和Cg-613与野生型TSG001生长速度均存在显著性差异，在菌落形态及颜色方面也存在较为明显的变异。6个转化子中，产孢量均显著低于TSG001菌株（187．5×106孢子／皿），其中，Cg-10、Cg-32、Cg-305和Cg-608产孢量均不到野生型产孢量的1／100；同时6个转化子分生孢子形态之间也存在较大差异。除Cg-608孢子萌发率（80％）及附着孢形成率（75％）与野生型TSG001无显著差异外，其余5个突变体均显著低于野生型。其中，Cg-32及Cg-613的分生孢子萌发率仅为2％，Cg-613附着孢形成率更是仅为1％，而突变体Cg-32在整个孢子萌发试验中未见任何附着孢产生。T-DNA插入拷贝数鉴定Southern杂交结果显示，突变体Cg-305为3拷贝突变体，Cg-608为双拷贝突变体，其它4个突变体Cg-10、Cg-32、Cg-573、Cg-613均为T-DNA单拷贝插入。单拷贝无致病性突变体侧翼序列分析根据T-DNA插入序列设计引物，采用反向PCR、TAIL-PCR及高效TAIL-PCR扩增出Cg-10和Cg-32的左右臂侧翼序列及Cg-613的右臂侧翼序列。通过序列编辑并进行Blastn搜索，结果表明，三个无致病性突变体Cg-10、Cg-32和Cg-613 T-DNA插入位点侧翼序列分别与24-C甲基转移酶、核糖体蛋白S11和真核翻译起始因子3三个致病性相关基因具有较高同源性。