人脂肪干细胞行Edu标记效果的实验研究

论文摘要

研究背景：人脂肪干细胞（ADSC,Adipose-derived stem cells）是从脂肪组织中分离出来的,并能显示出持续的细胞增殖能力及向不组织细胞定向分化的能力的细胞,具有组织量多,来源广泛的优点。近年来,被广泛地应用于基础研究及临床细胞治疗中,且具有巨大的发展潜力。自体脂肪移植在整形外科中广泛应用,但成活率低,需重复治疗等缺点是整形外科医生面临的重大问题。为了解决这一问题,需要对脂肪成活机制准确把握。在脂肪成活过程中,ADSC的作用尤为明显。一些理论推断脂肪干细胞的作用通过脂肪干细胞的增殖、分化成新的脂肪组织并提供适应的环境来促进脂肪的成活,但未有定论,且需要更多、更准确的实验来回答这一问题。我们的实验选用有种新的示踪剂,通过细胞示踪来探究脂肪干细胞在脂肪移植中的作用机制。Edu是一种核酸类似物,在细胞分裂增殖的过程中参与到核染色体中达到标记目的。目的：观察体外培养时不同培养阶段的人脂肪干细胞的细胞形态和生物学特点。通过实验初步确立最佳的标记浓度及标记时间组合。进一步交通过与未标记的干细胞的进行增殖及分化影响的比较以选出最适标记浓度及时间。方法：1、人ADSC的体外培养分离、培养和鉴定。经知隋同意后,取吸脂手术来源的脂肪颗粒,使用酶消化法获得SVF细胞,原代培养在7-10天时达80%-90%的细胞融合,干细胞进一步传代培养进行纯化和扩增。倒置显微镜下观察细胞形态变化。细胞传至第3代后,分别用于鉴定细胞及用于细胞标记的研究。2、Edu在不同浓度及时间标记的组合下进行研究。分别采5uM,10uM,20uM,50uM的浓度及12小时,24小时进行标记,Edu标记后的细胞去除含Edu的培养基,制成单细胞悬液并固定细胞,以Alexa-555染色后行流式细胞分析仪检测标记率,从而挑选出各时间点中较适宜的标记组合。3、测定Edu在较适宜的标记率情况下对细胞生长及分化的影响,以未标记细胞作为空白对照。Edu对干细胞细胞活性及增殖的影响以台盼蓝排斥反应及MTT实验证实。4、测定Edu标记后影响细胞分化的能力。即去除Edu后,脂肪干细胞行定向成脂及成骨诱导,诱导结束后行油红O染色及茜素红染色鉴定分化结果。数据以SPSS13.0进行分析。结果：原代细胞贴壁后呈一定方向的成纤维细胞样生长。在第5到第7天时细胞克隆逐渐变大并相互融合并形成单层。7-10天时将细胞消化下来并进行传代。传代后细胞生长迅速,2-3天即可长满培养皿的底部并进一步传代。3代细胞行流式细胞仪分析细胞表型时表达细胞表面标志如CD90,CD105,CD44,而且不表达或弱表达细胞表面标志CD34,CD45。Edu的标记是在细胞分裂增殖时,新合成的细胞才能被标记上。流式结果表明,分别在10uM,12h和5uM,24h标记时,细胞标记率可达约90%。更高的浓度并不能明显提高细胞的标记率,且会对细胞活性有影响。因此,选定此两组作为实验组,未标记细胞作为对照组,分析标记后对细胞增殖分化的影响。标记后的细胞即可被消化,制成单细胞悬液。台盼蓝排斥实验数据显示细胞死亡比例各组间无统计学差异。MTT实验分析,三组间10uM,12h与对照组曲线较相近,但略低,5uM,24h与对照组曲线较远,证实标记物对细施增殖有一定的影响,以10uM,12h组标记者影响较小。标记后的细胞去除Edu后定向分化,成脂诱导2周,成骨诱导3周。分别以油红O染色及茜素红染色,随机每高倍镜视野下计数成脂细胞数及钙结节数,数据分析后发现二者无统计学意义。本实验在体外培养脂肪干细胞时,确认P3代以后的细胞较为纯化化并可以用来实验分析。应用Edu标记脂肪干细胞并首次应用流式方法测定其精确的标记率,通过对其生长及定向分化能力的测定,得出最适浓度组合10uM,12h,对进一步研究脂肪干细胞在辅助脂肪移植中的作用具有指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 第一部分 不同浓度EdU对ADSC标记率的研究
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 最适浓度EdU对ADSC增殖及分化影响的研究
• 目的
• 方法
• 结果
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢