腈水合酶产生菌株的酶反应条件优化及细胞固定化的研究

论文摘要

丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化学品。微生物法生产丙烯酰胺具有反应条件温和、丙烯腈转化率高和生产成本低等突出的优点,近年来成为丙烯酰胺生产的研究热点。腈水合酶是丙烯酰胺生物法生产的催化剂,因此腈水合酶的高效表达是提高丙烯酰胺生产效率的关键。本文利用前期研究中从化工废水活性污泥中分离并选育的腈水合酶产生菌株Rhodococcus sp.HUST-1,进行了丙烯酰胺的检测方法、腈水合酶的反应条件优化和动力学、腈水合酶的分离以及细胞固定化技术等方面的研究,以下为主要研究成果:1.通过研究分别确定了溴化法、气相色谱法和反相高效液相色谱法检测丙烯酰胺的最佳检测条件,并通过对三种检测方法的比较分析,确定了丙烯酰胺的检测方案:采用反相高效液相色谱法进行丙烯酰胺定性分析,采用溴化法进行丙烯酰胺含量的测定。2.通过酶反应条件的优化,确定最佳底物浓度为40g/L,反应温度为28℃,反应体系pH为7.0,在最佳条件下的比酶活为119U/（mg干细胞重）。菌体最高加入量为15mL,比酶活达1218U/mg。菌株HUST-1产生的腈水合酶米氏常数km=6.124g/L,表观活化能为Ea=47.8kJ/mol。失活动力学方程为:lnk1=0.9391 0.0548-（1334.3 38.7）/T。酶失活反应的表观活化能为85.9kJ/mol。3.采用甲苯、丙酮、Triton X-100、溶菌酶和自溶法等非机械破碎法对菌株Rhodococcus sp.HUST-1进行细胞破碎,结果表明,溶菌酶具有较好的细胞破碎效果。在1g湿菌体中加入7mg溶菌酶,破碎时间为10h的条件下,菌株HUST-1细胞破碎后的腈水合酶酶活为1308U,比破碎前提高了29.2%。4.采用海藻酸钙包埋法、聚乙烯醇交联法和联合包埋法进行腈水合酶产生菌株HUST-1的细胞固定化研究。研究结果表明,采用海藻酸钙、聚乙烯醇和活性炭的联合包埋法进行细胞固定化的效果最佳,使固定化细胞的相对酶活达115.7%,联合固定化的应用显著提高了反应体系中单位体积内的生物量,可使单位体积内的固定化小球酶活比自由细胞酶活提高15.7%,比未加入活性炭前的最高酶活提高了28.5%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 丙烯酰胺生产技术回顾
• 1.1.1 硫酸法制丙烯酰胺
• 1.1.2 催化水合法
• 1.1.3 微生物法生产丙烯酰胺
• 1.2 腈水合酶的基本性质
• 1.2.1 腈水合酶的种类及分布
• 1.2.2 腈水合酶的生物合成调节及其结构特点
• 1.2.3 腈水合酶催化反应特性及其反应机理
• 1.2.4 腈水合酶的光敏性
• 1.2.5 腈水合酶的热稳性
• 1.3 课题背景
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 研究目的与意义
• 1.3.3 本课题的主要研究内容
• 第2章 丙烯酰胺分析方法的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 分析方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 溴化法测定条件的选择
• 2.2.2 气相色谱法测定条件的选择
• 2.2.3 液相色谱法测定条件的选择
• 2.2.4 三种方法对丙烯酰胺检测的比较分析
• 2.3 本章小结
• 第3章 腈水合酶反应条件的优化及动力学的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种和培养基
• 3.1.2 仪器和试剂
• 3.1.3 细菌和酶活测定方法
• 3.1.4 底物丙烯腈浓度对酶活的影响
• 3.1.5 温度对酶活的影响
• 3.1.6 pH 对酶活的影响
• 3.1.7 菌体加入量对酶活的影响
• 3.1.8 丙烯酰胺浓度对反应速率的影响
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 底物丙烯腈浓度对酶活的影响结果
• 3.2.2 温度对酶活的影响结果
• 3.2.3 pH 对酶活的影响结果
• 3.2.4 菌体加入量对酶活的影响结果
• 3.2.5 丙烯酰胺浓度对酶活的影响结果
• 3.2.6 催化反应动力学参数的计算
• 3.2.7 失活动力学的研究
• 3.3 本章小结
• 第4章 腈水合酶分离技术的初步研究
• 4.1 细胞破碎法简介
• 4.1.1 化学渗透法
• 4.1.2 酶溶法
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种和培养基
• 4.2.2 仪器和试剂
• 4.2.3 细菌和酶活测定方法
• 4.2.4 甲苯破碎
• 4.2.5 丙酮破碎
• 4.2.6 盐酸胍破碎
• 4.2.7 Triton X-100 表面活性剂破碎
• 4.2.8 溶菌酶破碎
• 4.2.9 自溶法破碎
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 甲苯对菌株HUST-1 的破碎作用
• 4.3.2 丙酮对HUST-1 的破碎作用
• 4.3.3 盐酸胍对HUST-1 的破碎作用
• 4.3.4 Triton X-100 对HUST-1 的破碎作用
• 4.3.5 溶菌酶对HUST-1 的破碎作用
• 4.3.6 自溶法对HUST-1 的破碎作用
• 4.4 本章小结
• 第5章 固定化细胞催化水合丙烯腈的研究
• 5.1 固定化细胞技术简介
• 5.1.1 固定化细胞的优缺点
• 5.1.2 固定化细胞的方法
• 5.1.3 固定化细胞的应用
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌种和培养基
• 5.2.2 仪器和试剂
• 5.2.3 方法
• 5.3 固定化细胞催化的研究
• 5.3.1 海藻酸钙包埋法
• 5.3.2 PVA 交联法
• 5.3.3 PVA-海藻酸钙联合包埋法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 海藻酸钙包埋法的研究结果
• 5.4.2 PVA 交联法的研究结果
• 5.4.3 联合包埋法的研究结果
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢