Smad4基因在HO-8910和HO-8910PM中的表达及其对肿瘤转移作用的研究

论文摘要

目的:恶性肿瘤是当今世界上严重危害人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的转移所导致的多脏器功能衰竭是患者死亡的主要原因。随着肿瘤转移基因调控下的多阶段、多因素、多步骤理论的不断完善,人们对于肿瘤转移这一极为复杂的病理过程有了更进一步的认识。发现并证实与肿瘤转移过程高度相关的基因已成为肿瘤转移机制研究领域的热点,因为这些基因可以使我们更深入的了解肿瘤转移的机理,同时,这些基因及其产物,有可能成为抗肿瘤转移的靶点或观察肿瘤患者预后、转移的指标。转化生长因子β（TGF-β）可以抑制上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞,以及某些肿瘤细胞的生长[1,2];也可诱导肝癌细胞、淋巴细胞、前列腺上皮细胞等发生凋亡[3-5]。TGF-β与其效应细胞表面的Ⅱ型受体TβRⅡ和Ⅰ型受体TβRⅠ形成的异源二聚体结合,相继激活TβRⅡ和TβRⅠ,活化的TβRⅠ再进一步活化Smad2和Smad3,磷酸化的Smad2/3必须与Smad4结合形成复合物,才能进入细胞核,调节靶基因的转录[6]。Smad4是TGF-β信号通路上一个中枢性的信号转导分子。目前,对TGF-β/Smad信号通路的研究主要集中在胰腺癌等胃肠道肿瘤和血液肿瘤上,对卵巢癌的研究报道较少。卵巢癌是女性生殖器三大恶性肿瘤之一,至今缺乏有效的早期诊断方法,病人就诊时多是中晚期,卵巢癌具有癌细胞从癌体脱落,进入腹水,继而在腹膜、网膜、肠浆膜表面广泛种植等特点。研究表明,Smad4的过表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和细胞外基质的合成并诱导凋亡。近年证实,Smad4的表达水平与一些恶性肿瘤的发生发展、生物学行为及其预后有密切关系。不少学者认为Smad4的失活发生在肿瘤进展的后期,属于晚期分子事件,并与肿瘤的浸润和转移密切相关。我们利用高低转移性人卵巢癌细胞系HO-8910和HO-8910PM细胞株作为对象,研究Smad4蛋白在这两种肿瘤细胞中表达的差异,并通过基因转染技术过表达Smad,检测TGF-β/Smad信号通路下游靶基因PAI-1、VEGF的表达,同时检测了另一个转移相关基因E-钙粘附蛋白的表达,应用Transwell小室法及细胞划痕实验测定转染前后细胞侵袭迁移能力,探讨Smad4基因与肿瘤转移的关系及其分子机制。方法:1、检测Smad4基因在HO-8910和HO-8910PM细胞系中的表达:①通过免疫细胞化学方法检测Smad4的细胞定位。②通过Western blot方法检测Smad4蛋白在HO-8910和HO-8910PM细胞系中表达的差异。2、构建Smad4真核表达载体,脂质体法瞬时转染Smad4基因,转染后48小时Western blot方法检测Smad4、PAI-1、VEGF、E-cadherin的表达。3、Transwell小室检测转染前后细胞侵袭能力的差。4、划痕实验检测转染前后细胞迁移能力差异。5、粘附实验检测转染前后细胞与基底膜粘附力的差异。6、明胶酶谱法检测转染前后细胞上清中MMP2、MMP9的表达及活性。结果:1、免疫细胞化学方法分析显示Smad4基因在细胞核/质表达,且在HO-8910中高表达,在HO-8910PM中极低表达。2、Western blot检测Smad4基因在HO-8910中高表达,而在HO-8910PM中低表达。3、瞬时转染Smad4基因可以下调PAI-1、上调E-cadherin的表达,而转染前后VEGF表达无明显差异。4、Transwell实验结果表明PM/Smad4细胞穿透Matrigel膜细胞数较未转染组明显减少（P<0.05）。5、细胞迁移实验结果表明PM/Smad4迁移速度明显低于未转染细胞（P<0.05）。6、粘附实验结果表明PM/Smad4细胞粘附于基底膜的数量明显高于未转染细胞（P<0.05）。7、HO-8910、HO-8910PM、PM/Smad4细胞上清中MMP2、MMP9的表达及活性除MMP2前体型无明显差异。结论:1、Smad4基因在HO-8910中高表达,在HO-8910PM中低表达,表明Smad4基因与肿瘤转移有关。2、Smad4可以抑制HO-8910PM细胞体外侵袭能力,其对侵袭能力的影响不是通过MMP2、MMP9起作用。3、Smad4基因可以抑制HO-8910PM细胞体外迁移能力。4、Smad4基因可以提高HO-8910PM细胞与基底膜的粘附能力。5、Smad4基因通过调节PAI-1、E-cadherin的表达抑制肿瘤转移。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料
• （五） 方法
• （六） 结果
• （七） 讨论
• （八） 结论
• （九） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢