美达霉素产生菌菌种鉴定及调控基因med-ORF10的功能研究

论文摘要

菌株AM-7161（AM-7161）能够产生具有强抗肿瘤活性的抗生素美达霉素（medermycin）,作为一株重要的抗生素产生菌,迄今为止并未进行系统的分类鉴定,文献中仅根据形态认为是链霉菌（Streptomyces sp. AM-7161）;med-ORF10是美达霉素生物合成途径中的一个重要基因,通过前期工作初步认为是一新型转录调控基因。本研究首先对链霉菌AM-7161进行分类鉴定,并利用生物信息学分析、基因互补和基因突变手段对med-ORF10展开功能研究,内容如下：在不同条件下培养AM-7161并观察其培养形态、生长情况及产素情况,以及进行扫描电镜观察、革兰氏染色等,表明：AM-7161为典型链霉菌形态,但较一般链霉菌生长迅速；克隆其16S rRNA进行同源性分析及系统进化树分析表明：AM-7161与纳士维尔链霉菌xsd08147 （Streptomyces nashvillensis strain xsd08147）序列同源性高达99%,确定其为纳士维尔链霉菌的一个亚种；对Med-ORF10的一级、二级及三级结构进行生物信息学分析,结果显示：Med-ORF10为一个非常小的疏水蛋白分子,具有一个SH3 （Src homolog 3）基序和一个酪蛋白激酶2（CK2）基序；仅含一个NTF2 （Nuclear transportor factor 2,核运输因子2）结构域；其同源基因在芳香聚酮抗生素基因簇中广泛存在,推测是抗生素合成必须基因；与放线紫红素生物合成基因簇中的acfⅥ-ORFA（编码新型正调控蛋白）同源性最近,推测二者功能一致；对med-ORF10的功能进行体内遗传学分析：表明med -ORF10突变导致美达霉素的积累量和孢子产量下降；互补后发现美达霉素的积累和孢子产量均有一定程度的恢复,推测med-ORF10是美达霉素合成中的调控基因,同时有可能会影响到菌株的分化；以上研究结果初步确定了美达霉素产生菌链霉菌AM—7161的分类地位,并且为美达霉素生物合成调控基因的研究奠定了良好基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 链霉菌和抗生素
• 1.1.1 链霉菌
• 1.1.2 链霉菌源抗生素
• 1.2 抗生素生物合成与调控
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 抗生素生物合成
• 1.2.3 抗生素合成调控方式
• 1.3 抗生素产生菌菌种鉴定
• 1.3.1 传统分类法
• 1.3.2 16SrRNA序列分析技术
• 1.4 美达霉素的生物合成与调控
• 1.4.1 美达霉素
• 1.4.2 美达霉素生物合成及调控
• 1.5 本研究内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 培养基
• 2.3.1 大肠杆菌培养基
• 2.3.2 链霉菌培养基
• 2.4 试剂和溶液
• 2.4.1 大肠杆菌质粒提取试剂
• 2.4.2 链霉菌总DNA提取试剂
• 2.4.3 缓冲液
• 2.4.4 其他试剂
• 2.4.5 抗生素
• 2.4.6 酶和试剂盒
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取
• 2法）及DNA转化'>2.5.2 大肠杆菌感受态细胞制备（CaCl₂法）及DNA转化
• 2.5.3 DNA体外操作
• 2.5.4 链霉菌培养以及菌种保藏
• 2.5.5 链霉菌总DNA的提取
• 2.5.6 链霉菌原生质体的制备
• 2.5.7 链霉菌原生质体转化
• 第三章 美达霉素产生菌菌株鉴定及产素研究
• 3.1 美达霉素产生菌菌株鉴定
• 3.1.1 培养形态观察
• 3.1.2 生理生化分析
• 3.1.3 16SrRNA分析
• 3.2 美达霉素产生菌产素时间研究
• 3.3 讨论
• 第四章 Med-ORF10生物信息学分析
• 4.1 med-ORF10 DNA序列分析
• 4.2 Med-ORF10一级结构分析
• 4.3 Med-ORF10三级结构模拟
• 4.4 Med-ORF10特异位点搜索
• 4.5 Med-ORF10保守区域预测
• 4.5 med-ORF10及同源基因产物系统进化发育树
• 4.6 讨论
• 第五章 med-ORF10体内遗传学分析
• 5.1 med-ORF10突变导致美达霉素及产孢的变化
• 5.2 med-ORF10基因回补分析
• 5.3 med-ORF10基因突变分析
• 5.4 讨论
• 总结和展望
• 参考文献
• 硕士期间论文发表
• 致谢