鸡ADFP和PLIN基因与脂肪组织生长发育关系的遗传学研究

论文摘要

脂肪性状是优质鸡肉品质评价的重要指标,此类性状的发育会直接影响其商品性能。因此,有必要开展调控脂肪性状发育的基因的研究。Adipocyte differentiation-related protein（ADFP）和Perilipin是覆盖在脂滴表面的磷蛋白,对人和鼠脂肪细胞的脂质代谢有重要的调控作用。由于两种蛋白参与了糖尿病、肥胖症和动脉粥样硬化的异常脂质代谢,在国外,ADFP和Perilipin在持续十七年的时间中一直是研究的热点。在人和小鼠上开展ADFP和Perilipin的研究对深入研究鸡脂肪性状遗传机制有很好的借鉴作用。本研究以地方品种四川山地乌骨鸡为试验材料,克隆获得了鸡PAT家族成员ADFP和基因PLIN的全编码区序列（1317bp和1554bp）（GenBank accession numbers:EU620700和EU620701）,并翻译获得其氨基酸序列（438aa和515aa）。通过多种生物信息学分析方法,确定两条氨基酸序列具有PAT家族的结构特征,是鸡PAT家族成员ADFP和PLIN蛋白。本研究以地方品种四川山地乌骨鸡、藏鸡和培育优质鸡“大恒”S01系为试验材料,采用SYBR greenⅠ定量PCR分析ADFP基因和PLIN基因在1日龄和84日龄两个时间点品种间的表达差异,同时分析了四川山地乌骨鸡胚胎期（第9天和第15天）、1日龄和84日龄等4个时间点ADFP基因和PLIN基因表达的组织差异,以及胸肌、肝脏、腹脂和皮脂组织中ADFP基因和PLIN基因表达量的发育性变化同皮脂厚、肌内脂肪含量、活重和冠重等四个表型性状累积生长值之间的关系。结果表明,ADFP基因和PLIN基因在鸡不同生长发育阶段都有表达,并且在不同阶段各有优势表达组织,同一组织中也有表达的优势时间点;腹脂组织中ADFP基因的发育性变化与活重和冠重的累积生长值成显著正相关（P＜0.05）,胸肌组织中ADFP基因的发育性变化与肌内脂肪含量的累积生长值成显著正相关（P＜0.05）;腹脂组织中PLIN基因的发育性变化与皮脂厚的累积生长值成极显著地正相关（P＜0.01）,胸肌组织中PLIN基因的发育性变化与肌内脂肪含量的累积生长值成极显著地正相关（P＜0.01）。这说明,ADFP和PLIN基因表达量与鸡脂肪组织,尤其是肌内脂肪含量的发育紧密相关。通过研究四川山地乌骨鸡各组织的ADFP和PLIN基因表达量倍比值的发育性变化,发现皮脂和腹脂组织中ADFP和PLIN表达量比值变化随机体的生长发育呈先升后降的趋势。由此推测,随着脂肪组织中脂肪细胞的发育成熟,ADFP和PLIN基因先后对鸡脂肪组织的代谢发挥主要调控作用。本研究以地方品种四川山地乌骨鸡、广东惠阳胡须鸡、封开杏花鸡、清远麻鸡、广西霞烟鸡、四川大恒优质鸡8个品系、岭南黄鸡矮小型麻羽专门化品系（E2）、岭南黄鸡Ⅱ号配套系（DC）和引进肉鸡品种爱拔益加等16个群体,共430个个体为试验材料,采用PCR-SSCP的方法设计引物,扫描ADFP和PLIN基因外显子序列和邻近内含子序列。结果,在ADFP基因中检测到3个单核苷酸突变位点,分别位于内含子4、内含子5和外显子8（第398氨基酸残基处）。具体为Z染色体33 394 913位（SNP1）A→T,33 395 676位（SNP2）C→T,33 397 903位（SNP3）A→G。与dbSNP数据库的SNP比对分析,发现三个突变位点为新的突变位点。在ADFP基因的三个突变位点中,等位基因A、C和G依次为SNP1（A/T）、SNP2（C/T）和SNP3（A/G）的优势等位基因。ADFP基因单突变位点与16个群体的屠宰性状关联分析结果显示,SNP3对肌内脂肪含量的遗传效应达到显著水平（P＜0.05）。同时,SNP1对全净膛重、腹脂重和腹脂率的遗传效应达到显著水平（P＜0.05）,SNP2对胸肌重、腹脂重和皮脂厚的遗传效应达到显著水平（P＜0.05）。单倍型与16个群体的屠宰性状关联分析结果显示,单倍型组合对胸肌重、腹脂重和腹脂率的遗传效应达到显著水平（P＜0.05）。这说明ADFP基因突变位点与屠宰性状,尤其是脂肪性状显著相关,该基因可能是影响鸡的脂肪性状的主效基因或与控制这些性状的QTL连锁。在PLIN基因中检测到3个单核苷酸突变位点,分别位于外显子2（第7氨基酸残基）和外显子7（第285氨基酸残基和第289氨基酸残基）。具体为10染色体14 521351位（SNP1）T→C,14 523 391位（SNP2）C→T,14 523 402位（SNP3）G→A。与dbSNP数据库的SNP比对分析,发现三个突变位点为新的突变位点。在PLIN基因的三个突变位点中,SNP1（T/C）和SNP2（C/T）各基因型和等位基因在16个群体中随机分布,没有明显的优势基因型和等位基因;SNP3（G/A）基因型GG和等位基因G在16个群体中均为优势基因型和等位基因。突变位点SNP1和SNP2具有中等的多态信息含量。单突变位点与16个群体的屠宰性状关联分析结果显示,SNP1、SNP2和SNP3分别对肌内脂肪含量、胸肌重和屠体重有显著地遗传效应（P＜0.05）。单倍型与16个群体的屠宰性状关联分析结果显示,单倍型组合对皮脂厚有显著的遗传效应（P＜0.05）。这说明PLIN基因突变位点与屠宰性状,尤其是脂肪性状显著相关,该基因可能是影响鸡脂肪性状的主效基因或与控制这些性状的QTL连锁。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 常用词语缩写
• 第一章 文献综述
• 1.1 优质鸡与脂肪性状
• 1.2 家禽脂肪组织的发育与代谢调控
• 1.2.1 脂肪细胞的分化
• 1.2.2 脂肪细胞的分布
• 1.2.3 脂肪代谢的基本过程
• 1.2.3.1 甘油三酯的合成代谢
• 1.2.3.2 甘油三酯的分解代谢
• 1.2.4 家禽脂肪代谢调控关键因素
• 1.2.4.1 脂肪合成调控关键点
• 1.2.4.2 脂肪分解调控关键点
• 1.3 PAT家族研究进展
• 1.3.1 PLIN基因的研究进展
• 1.3.1.1 Perilipin的发现及其三种亚型
• 1.3.1.2 Perilipin的结构与生物学功能
• 1.3.1.3 Perilipin的调控机制
• 1.3.1.4 Perilipin与其它脂滴表面蛋白的关系
• 1.3.1.5 PLIN基因的多态性研究
• 1.3.1.6 Perilipin与人类疾病
• 1.3.1.7 Perilipin的研究前景
• 1.3.2 ADFP基因研究进展
• 1.3.2.1 脂肪分化相关蛋白
• 1.3.2.2 ADFP的生物学功能
• 1.3.2.3 ADFP的调控机制
• 1.3.2.4 ADFP与疾病的关系
• 1.3.2.5 ADFP与Perilipin的关系
• 1.3.2.6 ADFP的研究前景
• 1.4 分子遗传标记对优质鸡性状的辅助选择研究
• 1.4.1 分子标记概述
• 1.4.2 单链构象多态性（PCR-SSCP）检测技术
• 1.4.3 MAS在家禽育种中的应用与研究简况
• 1.4.4 分子标记技术的应用前景与展望
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 ADFP和PLIN基因编码区的克隆及生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.2.2.1 试剂与仪器名称
• 2.2.2.2 主要试剂的配制
• 2.2.3 试验方法
• 2.2.3.1 引物设计与合成
• 2.2.3.2 试验步骤
• 2.3 结果
• 2.3.1 RNA质量
• 2.3.2 ADFP和PLIN基因目的片段的扩增和克隆结果
• 2.3.2.1 RT-PCR结果
• 2.3.2.2 重组质粒的构建
• 2.3.2.3 重组质粒的鉴定
• 2.3.3 目的片段的测序结果
• 2.3.3.1 克隆所得ADFP cDNA序列（EU620700）
• 2.3.3.2 克隆所得PLIN cDNA序列（EU620701）
• 2.3.4 鸡ADFP基因生物信息学分析
• 2.3.4.1 序列比对结果
• 2.3.4.2 鸡ADFP基因CDS序列的碱基组成
• 2.3.4.3 鸡ADFP基因CDS密码子使用及氨基酸组成
• 2.3.4.4 磷酸化位点预测
• 2.3.4.5 疏水性分析
• 2.3.4.6 蛋白质的跨膜螺旋特征
• 2.3.4.7 鸡ADFP蛋白质二级结构的预测
• 2.3.4.8 鸡ADFP蛋白质三级结构的预测
• 2.3.4.9 鸡ADFP保守结构域预测
• 2.3.5 鸡PLIN基因生物信息学分析
• 2.3.5.1 序列比对结果
• 2.3.5.2 鸡PLIN基因CDS序列的碱基组成
• 2.3.5.3 鸡PLIN基因CDS密码子使用及氨基酸组成
• 2.3.5.4 磷酸化位点预测
• 2.3.5.5 疏水性分析
• 2.3.5.6 蛋白质的跨膜螺旋特征
• 2.3.5.7 鸡PLIN蛋白质二级结构的预测
• 2.3.5.8 鸡PLIN蛋白质三级结构的预测
• 2.3.5.9 PLIN保守结构域预测
• 2.3.6 鸡PAT家族成员间序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 克隆cDNA序列分析
• 2.4.2 蛋白质功能的确定
• 2.4.2.1 通过相似序列的序列比对确定功能
• 2.4.2.2 确定序列特性:疏水性、跨膜螺旋、磷酸化位点等
• 2.4.2.3 鸡PAT家族成员间序列分析和保守域分析
• 2.4.2.4 蛋白质三维结构预测
• 第三章 鸡ADFP和PLIN基因mRNA水平定量研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 四川山地乌骨鸡
• 3.2.1.2 四川"大恒"优质鸡
• 3.2.1.3 藏鸡
• 3.2.2 试剂和仪器
• 3.2.2.1 试剂
• 3.2.2.2 仪器
• 3.2.2.3 试剂的配制
• 3.2.3 试验方法
• 3.2.3.1 引物设计与合成
• 3.2.3.2 组织总RNA的提取
• 3.2.3.3 目的片断的扩增和标准品的制备
• 3.2.3.4 实时荧光定量PCR
• 3.2.4 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 常规PCR及测序结果
• 3.3.2 目的基因与管家基因的标准曲线及熔解曲线
• 3.3.3 ADFP基因和PLIN基因表达的品种差异
• 3.3.3.1 ADFP基因在1日龄四川山地乌骨鸡和藏鸡中的表达差异
• 3.3.3.2 PLIN基因在1日龄四川山地乌骨鸡和藏鸡中的表达差异
• 3.3.3.3 ADFP基因在70日龄四川山地乌骨鸡和优质鸡S01系中的表达差异
• 3.3.3.4 PLIN基因在70日龄四川山地乌骨鸡和优质鸡S01系中的表达差异
• 3.3.4 ADFP基因和PLIN基因表达的组织差异
• 3.3.4.1 ADFP基因的组织表达差异
• 3.3.4.2 PLIN基因的组织表达差异
• 3.3.5 ADFP和PLIN基因表达的发育性变化
• 3.3.5.1 ADFP基因表达的发育性变化
• 3.3.5.2 PLIN基因表达的发育性变化
• 3.3.6 四川山地乌骨鸡各性状累积生长值
• 3.3.7 ADFP和PLIN基因的相对表达量与性状的相关分析
• 3.3.7.1 ADFP基因的相对表达量与性状的相关分析
• 3.3.7.2 PLIN基因的相对表达量与性状的相关分析
• 3.3.8 ADFP与PLIN基因表达量的倍比关系
• 3.4 讨论
• 3.4.1 ADFP基因和PLIN基因表达量的品种差异
• 3.4.2 ADFP基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.3 PLIN基因相对定量结果及其与性状的相关分析
• 3.4.4 ADFP基因与PLIN基因表达量的倍比关系
• 第四章 鸡ADFP和PLIN基因的多态位点筛选及其遗传效应分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 试验鸡群
• 4.2.2 试剂和仪器
• 4.2.2.1 试剂
• 4.2.2.2 仪器与设备
• 4.2.2.3 缓冲液与常用试剂的配制
• 4.2.3 主要分子生物学软件
• 4.2.4 试验方法
• 4.2.4.1 屠宰性状、生长发育性能和肉质性能数据测定
• 4.2.4.2 引物的设计与合成
• 4.2.4.3 血样的采集及基因组DNA提取
• 4.2.4.4 PCR-SSCP分析
• 4.2.5 统计分析
• 4.2.5.1 基因型频率和基因频率
• 4.2.5.2 多态信息含量（PIC）
• 4.2.5.3 多态性位点的遗传效应统计分析模型
• 4.2.5.4 单倍型的构建
• 4.3 结果
• 4.3.1 基因组DNA提取结果
• 4.3.2 鸡ADFP基因的多态性及遗传效应
• 4.3.2.1 ADFP基因多态位点的检测
• 4.3.2.2 ADFP基因多态位点的基因型频率和等位基因频率
• 4.3.2.3 ADFP基因各位点多态信息含量（PIC）
• 4.3.2.4 数据的正态分布检验及非正态分布数据的转换
• 4.3.2.5 ADFP基因单突变位点对16个群体屠宰性状的遗传效应
• 4.3.2.6 ADFP基因单倍型构建及其对16个群体屠宰性状的遗传效应
• 4.3.2.7 ADFP基因单位点突变对四川山地乌骨鸡生长发育性能和肉质性状的遗传效应
• 4.3.2.8 ADFP基因单倍型构建及其对四川山地乌骨鸡生长发育性能和肉质性状的遗传效应
• 4.3.3 鸡PLIN基因的多态性及遗传效应
• 4.3.3.1 PLIN基因多态位点的检测
• 4.3.3.2 PLIN基因多态位点的基因型频率和等位基因频率
• 4.3.3.3 PLIN基因各位点多态信息含量（PIC）
• 4.3.3.4 数据的正态分布检验及非正态分布数据的转换
• 4.3.3.5 PLIN基因单突变位点对16个群体屠宰性状的遗传效应
• 4.3.3.6 PLIN基因单倍型构建及其对16个群体屠宰性状的遗传效应
• 4.3.3.7 PLIN基因单突变位点对四川山地乌骨鸡生长发育性能和肉质性状的遗传效应
• 4.3.3.8 PLIN基因单倍型构建及其对四川山地乌骨鸡生长性能和肉质性状的遗传效应
• 4.4 讨论
• 4.4.1 鸡ADFP基因的多态性及遗传效应
• 4.4.1.1 ADFP基因变异的鉴定
• 4.4.1.2 ADFP基因与表型性状间的连锁分析
• 4.4.2 鸡PLIN基因的多态性及遗传效应
• 4.4.2.1 PLIN基因变异的鉴定
• 4.4.2.2 PLIN基因与表型性状间的连锁分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录