重组人垂体腺苷酸环化酶激活多肽及其衍生多肽的研制、生物功能筛选及鉴定

论文题目: 重组人垂体腺苷酸环化酶激活多肽及其衍生多肽的研制、生物功能筛选及鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物医学工程

作者: 余榕捷

导师: 周天鸿

关键词: 重组,垂体腺苷酸环化酶激活多肽,受体,激动剂,环肽,发酵

文献来源: 暨南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是具有重要生物学功能和极具应用价值的神经多肽。为利用基因工程技术获得非融合的重组人垂体腺苷酸环化酶激活肽（recombinant human PACAP，rhPACAP），采用rhPACAP与纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）融合表达，并在两者之间引入Xa因子的识别位点（Ile-Glu-Gly-Arg↓）。融合蛋白CBD-PACAP经纤维素亲和层析纯化后，Xa因子酶切释放非融合重组PACAP。HPLC进一步纯化的重组PACAP多肽经Western blot与激光飞行质谱鉴定。制备的rhPACAP具有促进胰腺癌细胞株SW1990胞内cAMP合成的活性，表明其具有生物学活性。在两个融合蛋白（CBD-PACAP和CBD-IGF）中Xa因子识别位点（Ile-Glu-Gly-Arg↓）前引入7个氨基酸组成的富含甘氨酸柔性短肽（Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly），经比较Xa因子对引入短肽前、后融合蛋白的酶切效率后发现，短肽的引入不同程度地提高了融合蛋白CBD-IGF和CBD-PACAP对Xa因子的敏感性，此研究结果提供了一种提高Xa因子酶切效率的策略。为利用蛋白内含肽介导的一步纯化实现重组PACAP（RMPACAP）的高效制备，将目的多肽融合表达在具可诱导剪切功能的亲和纯化标签的N端，实现融合蛋白RMPACAP-intein-CBD的高效表达；融合蛋白经几丁质柱纯化后，硫醇诱导蛋白内含肽自动切割释放目的多肽RMPACAP；所制备的RMPACAP与天然PACAP38相比，在其N端多了一个甲硫氨酸（Met），但其促进SW1990细胞胞内cAMP生成的活性与PACAP38标准品相同。利用此工艺，1L的菌体培养物可获得22mg的纯度可高达98％的RMPACAP多肽。此研究建立了一种高效制备重组PACAP的方法。模仿已有的VPAC2受体特异激动剂序列，结合已建立的蛋白内含肽介导的多肽制备工艺，设计并实现4条重组多肽（RMROM、RROM、RMBAY和RBAY）的制备；四条重组多肽（50ng／kg）与高浓度葡萄糖（1.8mmol／kg）共同腹腔注射NIH小鼠时，均有效协助降低血糖；其中RMBAY的降糖作用较其它重组多肽显著，并可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌。RMBAY的筛选及其制备方法的建立为开展重组多肽RMBAY治疗Ⅱ型糖尿病的研究奠定基础。为从分子和细胞水平研究所制备的重组多肽RMPACAP及RMBAY对PACAP的三个受体的选择性（Selectivity）和激动性（Potency），从分子水平诠释重组多肽的作用机制，构建分别高效表达PACAP三个受体：PAC1、VAPC1和VPAC2的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞株。RT-PCR鉴定受体基因在mRNA水平的表达；Western blot和荧光免疫法鉴定VPAC1和VPAC2受体的表达。125I-PACAP38配体与受体结合实验检测PAC1受体的表达。重组多肽与125I-PACAP38对受体的竞争结合实验结果显示RMPACAP对三个受体均具有选择性；而RMBAY对VPAC2受体的IC50为70±5nmol／L，对VAPC1受体和PAC1受体的IC50均大于10μmol／L。重组多肽RMBAY促进VPAC2-CHO细胞株胞内cAMP产生的EC50为1.8±0.2nM，RMPACAP的EC50为5.3±0.3nM。RMBAY对VPAC2受体具有特异的选择性和激动性，是VPAC2受体的特异激动剂。RMBAY的筛选和鉴定为具有自主知识产权的VPAC2受体特异激动剂的研究和开发铺垫道路。为提高多肽的活性和稳定性，尝试利用蛋白内含肽可诱导剪切功能和多肽硫酯环合技术实现RCBAY环肽的制备。激光飞行质谱检测制备产物中含有成分的分子量为4128.10，与环肽的理论值相符。活性检测表明含有重组环肽RCBAY的制备产物与直链肽RMBAY相比，降血糖的作用更显著和持久。本研究提示RCBAY可能成为治疗Ⅱ型糖尿病的更有效的药物。在实验室水平确定工程菌RMBAY-ER2566的生长曲线，碳源，IPTG诱导时OD600，IPTG用量和诱导时间等参数。初步的探索结果表明：培养菌体至OD600达到0.5-1.0时加入IPTG至工作浓度0.4mmol／L，30℃诱导表达3-4h，或37℃诱导表达2-3h，均能有保证目的蛋白的高效表达。葡萄糖作为碳源抑制目的蛋白的表达。以实验室研究为参考，利用5L发酵罐发酵，3.5L发酵液收获湿重为113g的菌体，其中目的蛋白表达量达到30-35％，可溶性成分占可溶性蛋白的28-30％。工程菌RMBAY-ER2566的发酵为开展RMBAY作为VPAC2型受体特异激动剂的生物学研究及其医学应用奠定基础。总体上，本文主要利用基因工程原理和技术，结合蛋白内含肽可诱导剪切功能实现重组PACAP及其衍生多肽的高效制备；筛选并鉴定一条可高效协助机体降低血糖的新型VPAC2受体特异激动剂——RMBAY；尝试通过环化提高其活性和稳定性；开展工程菌中试发酵的研究；为具有自主知识产权的VPAC2受体特异激动剂的研究和开发奠定基础。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分 绪论

第一章 垂体腺苷酸环化酶激活多肽的研究概况

1.1 PACAP及其受体

1.2 PACAP的生物学功能

1.3 PACAP受体的特异激动剂和拮抗剂

第二章 蛋白内含肽及其应用

2.1 蛋白内含肽简介

2.2 蛋白内含肽介导蛋白纯化

2.3 蛋白内含肽介导蛋白环化

第三章 研究目的、研究意义及研究内容

3.1 研究目的

3.2 研究意义及研究内容

第二部分 重组PACAP的研制

第四章 非融合rhPACAP的制备及一种提高Xa因子酶切效率的策略

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 主要试剂

4.2.2 质粒、菌种和细胞

4.2.3 人工合成rhPACAP基因

4.2.4 表达质粒的构建

4.2.5 融合蛋白的表达

4.2.6 融合蛋白的纯化

4.2.7 Xa因子水解融合蛋白效率比较

4.2.8 rhPACAP的纯化

4.2.9 rhPACAP的HPLC鉴定

4.2.10 rhPACAP的活性测定

4.2.11 cAMP浓度测定

4.3.结果

4.3.1 表达质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定

4.3.2 融合蛋白的酶解和短肽的引入对酶切效率的影响

4.3.3 rhPACAP多肽的纯化和鉴定

4.3.4 rhPACAP的活性测定

4.4 讨论

4.4.1 非融合rhPACAP的制备

4.4.2 柔性短肽的引入提高Xa因子酶切效率

4.5 小结

第五章 蛋白内含肽介导RMPACAP的高效制备

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 主要试剂

5.2.2 质粒、菌种和细胞

5.2.3 编码RMPACAP基因的构建

5.2.4 重组表达载体pKY-PAC的构建

5.2.5 融合蛋白的表达

5.2.6 RMPACAP的纯化

5.2.7 RMPACAP的活性测定

5.2.8 蛋白测定

5.2.9 Tricine-SDS-PAGE

5.3.结果

5.3.1 RMPACAP基因的构建和重组表达载体pKY-PAC的构建

5.3.2 融合蛋白亲和层析和诱导蛋白内含肽在柱切割

5.3.3 RMPACAP的体外活性测定

5.4 讨论

5.4.1 RMPACAP的制备效率

5.4.2 RMPACAP的生物活性

5.5 小结

第三部分 VPAC2受体特异激动剂的研制、筛选、鉴定及改造

第六章、VPAC2受体特异激动剂的设计、制备及活性测定

6.1 前言

6.1.1 已确定的受体激动剂和拮抗剂及其应用

6.1.2 VPAC2受体激动剂的设计原则

6.1.3 新型VPAC2受体激动剂的设计及制备方案

6.2 材料与方法

6.2.1 主要试剂

6.2.2 质粒和菌种

6.2.3 编码RMROM和RROM基因的构建

6.2.4 编码RMBAY和RBAY基因的构建

6.2.5 重组表达载体pKY-ROM、pKY-BAY的构建

6.2.6 重组表达载体pTYB-ROM、pTYB-BAY的构建

6.2.7 RMROM和RMBAY的制备

6.2.8 RROM和RBAY的制备

6.2.9 RMPACAP断裂产物C-RMP的产生和鉴定

6.2.10 重组多肽的降血糖活性测定方法

6.3 结果

6.3.1 重组表达载体pKY-ROM、pKY-BAY的构建

6.3.2 重组表达载体pTYB-ROM、pTYB-BAY的构建

6.3.3 RMROM和RMBAY的制备

6.3.4 RROM和RBAY的制备

6.3.5 C-RMP的产生和鉴定

6.3.6 重组多肽降血糖的活性测定

6.4 讨论

6.4.1 重组多肽的制备及其制备效率的比较

6.4.2 重组多肽降糖活性的比较与分析

6.4.3 对降糖活性测定方法的讨论

6.4.4 多肽硫酯的水解

6.4.5 多肽硫酯的断裂

6.4.6 C-RMP的生物活性

6.5 小结

第七章 重组多肽对VPAC2型受体特异性和激动性的检测

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 主要试剂

7.2.2 质粒和细胞

7.2.3 表达载体pcDNA-PAC1的构建

7.2.4 重组表达质粒转染CHO细胞

7.2.5 分别高效表达3个受体的CHO细胞筛选

7.2.6 RT-PCR鉴定PAC1、VPAC1和VPAC2受体的表达

7.2.7 Western bolt鉴定VPAC1和VPAC2受体的表达

7.2.8 Immunofluorescenece assay鉴定受体的表达

7.2.9 ~(125)I-PACAP38检测PAC1受体表达

7.2.10 配体与受体的竞争性结合实验

7.2.11 RMBAY激活VAPC2受体的活性测定

7.3 结果

7.3.1 重组表达载体的鉴定

7.3.2 RT-PCR检测VPAC1、VPAC2和PAC1受体表达

7.3.3 Western blot和免疫荧光检测VPAC1和VPAC2受体的表达

7.3.4 ~(125)I-PACAP38配体结合实验检测PAC1受体的表达

7.3.5 RMPACAP和RMBAY对受体选择特异性

7.3.6 RMBAY和RMPACAP促进cAMP生成的活性测定

7.4 讨论

7.4.1 三个受体的特异高效表达及应用

7.4.2 RMBAY的受体选择性和激动性

7.4.3 PACAP受体与Ⅱ型糖尿病

7.5 小结

第八章 重组环肽RCBAY的制备和活性测定

8.1 前言

8.1.1 环肽的优势

8.1.2 蛋白内含肽介导环肽制备的工艺

8.2 材料与方法

8.2.1 试剂、质粒与菌种

8.2.2 RCBAY环肽线性前体的基因设计

8.2.3 重组表达载体pTW-BAY的构建

8.2.4 融合蛋白的表达

8.2.5 RCBAY的制备

8.2.6 RCBAY的体外降血糖活性测定

8.3 结果

8.3.1 重组表达载体pTW-BAY的构建

8.3.2 融合蛋白表达和亲和层析

8.3.3 蛋白内含肽的可诱导切割及目的环肽的制备和鉴定

8.3.4 RCBAY的活性测定

8.4 讨论

8.4.1 环肽制备产物的活性

8.4.2 环化效率

8.4.3 工艺特点

8.5 小结

第九章、菌种RMBAY-ER2566的中试发酵探索

9.1 前言

9.2.材料和方法

9.2.1 上罐前参数探索条件

9.2.2 蛋白电泳条件

9.2.3 发酵条件

9.3 结果

9.3.1 RMBAY-ER2566的生长曲线

9.3.2 诱导时间的选择

9.3.3 诱导剂IPTG的用量

9.3.4 IPTG诱导温度及诱导时间的筛选

9.3.5 碳源的筛选

9.3.6 发酵罐(5L)发酵

9.4 讨论

9.5 小结

结论、创新与不足之处

参考文献

附录

1、rhPACAP的飞行质谱

2、pKY-PAC的测序结果

3、RMPACAP的飞行质谱

4、pKY-ROM的测序结果

5、pKY-BAY的测序结果

6、pTYB-ROM的测序结果

7、pTYB-BAY的测序结果

8、新鲜制备的RMPACAP的飞行质谱

9、C-RMB的飞行质谱1

10、C-RMB的飞行质谱2

11、pTW-BAY的测序结果

12、RMBAY制备产物的飞行质谱

13、透析前RCBAY制备产物飞行质谱

14、透析后RCBAY制备产物飞行质谱

15、VPAC1基因及pcDNA-VPAC1测序

16、VPAC2基因及pcDNA-VPAC2测序

17、PAC1基因及pcDNA-PAC1测序

发表文章及申请专利

致谢

发布时间: 2008-01-10

参考文献

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