论文摘要
水稻是世界上最主要的粮食作物之一,全球约有一半的人以稻米作为主食。分蘖又是水稻与小麦等主要农作物的重要农艺性状之一,它直接影响农作物穗数的多少,从而影响单位面积的产量。控制水稻分蘖的相关基因的克隆及其功能分析研究是利用分子生物学技术进行水稻产量改良的理论基础。真核生物基因表达的调控是分子生物学研究的热点和前沿。基因表达的程序、时间和位置在不同层次上受不同的调节因素控制,这种控制机制不仅决定基因表达的水平也决定基因表达的时空顺序。作为转录水平上的一种重要的调控元件,启动子在植物基因表达的时间及空间上受到严格的调控。因而,分离、鉴别启动子和研究启动子的功能已经成为分子生物学的研究热点。本研究组从粳稻（Oryza sativa L.subsp.japonica）品种中花11号经0.1%EMS处理的后代中获得两份强分蘖突变体材料mt1-1和mt1-2,前期的研究将MT1基因定位于水稻第1染色体长臂的中下部,并且基于精细定位的结果,将MT1基因限定在BAC克隆AP003376上约30kb的区域内。该区域仅含有一个开放阅读框（ORF）,确定其为候选基因并完成了该基因的遗传互补测验。此外,通过在NCBI上进行BLASTp同源比对,我们在第1号染色体上发现一个与MT1高度同源的新基因,暂命名为MT2 ,所在BAC为AP003141。ClustalW （http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）结果显示,MT1和MT2基因AA的同源性高达63%。由此,我们将焦点集中于上述两个基因的启动子区,试图对启动子区进行分析从而去探索它们之间的异同。借助PCR和酶切的手段,克隆了强分蘖基因MT1和MT2的启动子区,并在此基础上构建了5’端缺失启动子与报告基因GUS的融合表达载体。以日本晴为受体材料,通过农杆菌介导法获得转基因植株。通过对报告基因GUS的定性和定量分析,我们对启动子的功能进行分析。GUS组织染色结果表明:对于MT1基因启动子,各载体幼嫩组织（叶片、茎节、根等）中均有GUS表达,显出蓝色,抽穗后组织中基因的表达量相对低于幼嫩组织,且在幼嫩的颖壳和枝梗中也显出弱蓝色;对于MT2基因启动子,各载体幼嫩组织（叶片、茎节、根等）中也均有GUS表达,显出蓝色;同样抽穗后的组织中表达量相对低于幼嫩组织,幼嫩的颖壳和枝梗中也显出弱蓝色,且饱满种子的枝梗中也有蓝色显示。GUS定量结果表明:对于MT1基因的启动子,一方面,比较了转入载体pC1301/MT1P-GUS的植株幼嫩组织叶片、茎节、根中的GUS比活,茎节中GUS比活最高,其次为叶,根中的表达最低;另一方面,比较了转入各载体的植株幼嫩组织茎节中GUS的比活:pC1301/MT1P-GUS > pC1301/MT1psmaⅠ-GUS > pC1301/MT1pkpnⅠ-GUS >pC1301/MT1p-GUS。对于MT2基因的启动子,我们也同样比较了上述两方面:叶中GUS比活最高,其次为茎节,根中的表达最低;另一方面则为pC1301/MT2P-GUS>pC1301/MT2psacⅠ-GUS >pC1301/MT2pkpnⅠ-GUS>pC1301/MT2p-GUS。我们猜测此表达结果应该与上游调控序列有一定关系。于是,对照PLACE结果进行分析,详细分析了各个基因以及基因间的差异,比较发现与分枝相关的顺式作用元件可能在此产生了一定程度的调节作用,并且,顺式作用元件的数量对表达强度也有一定程度的影响。同时,我们提取野生型品种南京6号的总RNA,借助于特异性引物,对MT1和MT2基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,对于MT1基因,叶、茎、节,穗中均有基因的表达;对于MT2基因,茎和叶中的表达处于低水平状态,节和穗中的表达较前两者高。但我们发现RT-PCR的结果与GUS定量的结果存在差异,并分析了产生差异的可能原因。