小麦条锈菌全基因组测序文库构建和原生质体制备研究

论文摘要

小麦条锈病是一种全球传播的流行性真菌性病害。小麦条锈病菌全基因组测序有助于更全面、深入认识其生理特点和致病机理,对预防和控制病害的发生和流行起着非常重要的作用。全基因组测序项目以条中32号生理小种为材料,采用全基因组鸟枪法Solexa测序结合Fosmid质粒两端Sanger法测序相结合的综合策略。本课题为整个测序项目的基础部分,主要完成了以下5方面的工作:1.完成了测序小种单孢菌系的分离纯化。采用传统生理小种鉴定方法,对单孢分离系进行了毒性鉴定,经鉴定的CYR32单孢菌系经扩繁后用于测序DNA提取。2.大片段DNA的提取和Fosmid基因组文库构建。以夏孢子萌发芽管为材料,采用改进方法成功获得大片段DNA,脉冲电泳检查片段主带大小在35-48 kb,回收大片段DNA,构建Fosmid质粒文库。文库含有20,000个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度平均为35 kb,对培养第一天和第六天的文库克隆进行比较检测结果表明,文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。3.高质量DNA提取和Solexa PE文库构建。以夏孢子为材料提取DNA,经纯化后OD260/280值在1.8～2.0之间,质量可满足测序PE文库构建要求;构建插入片段分别为200 bp、500 bp、2000 bp和6000 bp的Solexa PE测序文库。4.完成了2万个Fosmid克隆的两端测序和Solexa测序工作。对Solexa测序数据运用SOAPdenovo进行组装分析,结合Fosmid质粒测序数据构建Scaffold,获得基因组拼接总长度136Mb,scaffold的N50达到了119 kb。5.首次优化建立了小麦条锈菌原生质体制备实验体系。以夏孢子为材料,在10 ml 1.2 M KCl PH5.8的渗透压稳定剂中加入400 mg崩溃酶,15 mg几丁质酶,400 mg裂解酶,400mg纤维素酶,30℃处理54 h,成功制备了小麦条锈菌原生质体,为获得完整染色体DNA样品、分析脉冲电泳核型和基因组后期Scaffold标记定位奠定重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦条锈病
• 1.1.1 小麦条锈病的分布、特点、危害
• 1.1.2 小麦条锈菌生物学特性概述
• 1.1.3 小麦条锈病菌研究概况
• 1.2 微生物基因组研究进展
• 1.2.1 基因组学概述
• 1.2.2 测序技术的发展概况
• 1.2.3 生物信息学研究进展
• 1.2.4 微生物基因组研究的应用
• 1.3 原生质体研究概况
• 1.4 研究目的、意义
• 第二章 小麦条锈菌的纯化和鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种的纯化
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 第三章 用于小麦条锈菌全基因组测序的文库构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 DNA 样品检测
• 3.2.2　simid
• 3.2.3 GC 含量与 Depth 关联分析
• 3.2.4 非一致序列分析:K-mer 分析
• 3.2.5 Solexa 测序及序列组装
• 3.3 讨论
• 第四章 小麦条锈菌原生质体的制备
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料及试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介