RNA干扰及治疗性DNA疫苗抗乙型肝炎病毒研究

论文摘要

病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引起的一种严重危害人类健康的传染病。目前通常采用干扰素、核苷类似物和其它免疫调节剂等进行乙型肝炎的治疗。但由于乙肝病毒能以共价闭合环状DNA（cccDNA）的形式存在于肝细胞核内,而抗病毒治疗容易引起病毒的耐药性突变及其他的副作用,因此亟需发展新的有效的治疗药物和方法。RNA干扰现象的发现为病毒性乙型肝炎的有效治疗提供了一条新的思路。RNA干扰（RNA interference）是一种由双链RNA诱发降解同源mRNA的基因沉默（gene silencing）现象。该作用除了具有高度的特异性、高效性外,人们还可以针对病毒基因保守区域选择多个靶点进行RNAi治疗,以应对病毒变异产生逃避突变株,更重要的是RNAi在病毒非活跃复制期也能发挥作用。基于RNAi技术的众多优点,我们对应用RNAi进行抗乙肝病毒治疗的效果进行了研究,从RNAi靶序列的选择,siRNA的载体制备,它们在细胞模型和动物体内的抑制乙肝病毒基因表达的效果,及其剂量效应,时间效应和作用稳定性等方面进行了考察,希望为发展RNAi抗乙肝病毒药物提供参考。进一步地,我们还针对siRNA作为抗病毒药物应用的一个瓶颈问题:siRNA的输送和细胞转染效率,进行了研究。对提高质粒DNA的细胞转染和肝靶向输送进行了多种尝试,获得了有潜在应用价值的一些前期结果。虽然siRNA的体内输送和转染依然是限制RNAi相关药物研发的关键问题,希望我们的这些尝试能为最终的解决方案提供一些思路。最后,我们也对乙肝治疗新方案中的另一条重要思路:乙肝治疗性DNA疫苗的药效进行了研究。我们实验室在前期工作中,发展了DNA疫苗的电导入技术,免疫健康小鼠和恒河猴模型后,产生了快速和强烈的体液和细胞免疫。在本论文工作中,我们进一步地验证了产生的免疫应答对病毒蛋白的清除作用,我们分别使用模拟乙肝病毒感染的小鼠（尾静脉高压注射乙肝表面蛋白表达质粒）和感染乙肝病毒的狒狒（baboon）作为动物模型,观察电导入DNA疫苗后诱导的免疫应答情况及对乙肝病毒的清除情况,为治疗性疫苗的临床研究提供了重要的支持。本论文的主要内容及结果总结如下:1.我们根据国内乙肝病毒流行的情况和实验模型确定了研究用乙肝病毒的亚型并通过测序确定了基因序列,根据RNAi干扰作用的特点在乙肝病毒复制转录和分泌过程中发挥重要作用的表面蛋白编码区-S区选择了三段序列作为RNAi作用靶点,经BLAST验证与其它基因无明显同源性后针对这三个靶点用化学合成法制备了siRNA和化学修饰（其中对A,U碱基甲基化修饰）的siRNA,同时我们也设计了用于siRNA表达载体构建的DNA插入片段,并将其克隆到带人U6启动子的shRNA质粒表达载体上,经酶切及测序验证后大提纯化以用于细胞及动物实验。2.我们用细胞模型研究了siRNA对HBV抗原基因复制和表达的影响。我们首先将siRNA、甲基化修饰siRNA或shRNA表达质粒与乙型肝炎病毒表面抗原真核表达质粒（pHBS）共转染HuH-7细胞,结果表明针对S区基因筛选和合成的siRNA都能在肝细胞中明显降解靶基因mRNA,减少表面抗原的形成（抑制率达到80-90%）,同时它们的作用随着剂量的增加而加强,针对三个靶点的siRNA同时使用也可以一定程度上增强对表面抗原合成的抑制作用。不过三种形态的siRNA的作用和动力学特征有所不同,其中siRNA作用较强但作用维持时间较短;甲基化修饰一定程度上影响了siRNA的干扰作用,但另一方面也增加了siRNA的稳定性,延长了干扰作用的时间;而shRNA表达质粒的作用与siRNA相似,但它的作用时间明显比siRNA和甲基化修饰的siRNA长。在利用HepG2.2.15细胞模型进行siRNA对乙肝病毒复制和转录影响的研究中,我们证实siRNA能够明显地降低细胞和培养液中的乙肝病毒DNA和表面抗原的水平,抑制率可以达到60%以上（不考虑已经存在的病毒DNA和蛋白及细胞的转染效率）,而且我们发现siRNA在对HepG2.2.15细胞中对乙肝病毒的抑制具有剂量效应,甲基化修饰siRNA对病毒复制和转录的抑制作用虽然略低于siRNA,但能够持续更长时间。3.在证明siRNA可以在体外有效的干扰乙肝病毒的转录和复制后,我们研究了不同结构的siRNA在小鼠肝脏内对乙肝表面抗原表达的抑制作用和特征。结果发现与pHBS共转染的不同形态的siRNA都能够明显降低表面抗原mRNA的水平并减少蛋白的生成,它们的作用同样表现出剂量效应。siRNA的作用在三天以后明显降低,甲基化修饰siRNA的作用能够维持相对较长的时间,但在第五至七天也基本消失,而shRNA表达质粒的作用是最稳定的,在第十一天依然能抑制50-60%的抗原表达,在注射后三十天还能检测到它对乙肝蛋白形成的抑制。siRNA不仅能够抑制与之共转染的pHBS的转录,对预先在小鼠肝脏中存在并表达的质粒的转录也有抑制作用,不考虑已经存在于肝细胞中的蛋白及质粒的转染效率,siRNA在第一天就可以抑制60%的蛋白生成,第二天达到80%左右,表面抗原在血液中滴度的降低更加明显,到第二天已基本检测不到抗原的存在。另外我们还发现siRNA可以使乙肝表面抗原的形成量降低到不足以在体内诱导相应抗体的产生。4.siRNA的体内靶向输送是其用于抗病毒治疗的一个主要障碍,在体外实验中我们发现用脂质体结合DNA转染HepG2.2.15的效果不好,而在体内尾静脉注射后则基本看不到效果。为了提高脂质体的细胞转染效率及体内输送和转染的效率,我们进行了一系列的尝试。体外实验发现用脂质体包裹密度较大的钆喷酸葡胺或碘海醇溶液可以明显提高质粒对细胞的转染效率（5倍到25倍）,但碘海醇脂质体的细胞毒性明显低于钆喷酸葡胺脂质体。另外我们尝试了使用不同的物理化学输送方法,包括Hydrodynamic注射,含气脂质体超声输送,肝脏介入,肝脏直接注射及电转染和多室脂质体载体等用于小鼠肝靶向DNA输送,结果发现通过使用含气脂质体,多室脂质体,肝脏介入,肝脏直接注射及电转染等方法都可以一定程度的提高质粒DNA的针对肝细胞的靶向输送,但转染效率的提高并不明显。而Hydrodynamic注射可以非常高效率的将质粒DNA特异的输送到肝脏,但该方法无法用于临床,因此还需要寻找其它高效的肝靶向siRNA输送方法。5.我们将乙肝表面抗原表达质粒（pHBS）作为HBV-DNA疫苗研究了在电转染作用下在小鼠体内的免疫诱导情况并对模拟急性感染的乙肝病毒的清除能力。实验结果表明给小鼠注射5μg的表面抗原表达质粒并给予电脉冲刺激能够明显提高表面抗原诱导的体液免疫并使产生的抗体更快的达到保护水平,而且作为主要细胞免疫应答代表的IFN-γ的水平也明显比对照组高。在小鼠产生抗体以后,经尾静脉高压注射乙肝表面抗原表达质粒模拟病毒感染,结果显示经质粒电转染免疫的小鼠其肝内的表面抗原的最高水平只有对照组的10%左右,而且在第三天就已经检测不到;血液中表面抗原的变化更加明显,在注射抗原表达质粒12小时后根本检测不到表面抗原的存在,既便是在对照组抗原表达达到高峰的24小时,其血液依然为HBsAg阴性。免疫组化结果证明肝脏中表面抗原阳性细胞的数量及表面抗原的水平明显低于对照组。HE染色发现肝组织没有明显的坏死和淋巴细胞浸润,而且免疫组和对照组的ALT水平也没有显著性的差异,表明细胞免疫对抗原的清除可能主要通过以干扰素为代表的细胞因子的作用,而非CTL的溶细胞作用。乙肝病毒狒狒的乙肝DNA疫苗电转染免疫实验正在进行中。

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摘要

Abstract

第一章综述

1. 乙型肝炎

1.1 乙型肝炎病毒

1.1.1 乙型肝炎病毒的形态与结构

1.1.2 乙型肝炎病毒的基因结构

1.1.3 乙型肝炎病毒的亚型

1.1.4 乙型肝炎病毒的感染与复制

1.1.5 病毒性肝炎的发病机理及慢性乙型肝炎的形成

1.2 慢性乙型肝炎的治疗

1.2.1 干扰素抗乙型肝炎病毒治疗

1.2.2 核苷类似物抗乙型肝炎病毒治疗

1.2.3 免疫调节治疗

1.2.4 其它治疗方法

1.2.5 正在研究的抗乙肝病毒药物

1.2.6 病毒性肝炎抗病毒治疗存在的问题

2. RNA干扰技术

2.1 RNA干扰的发现及研究进展

2.2 RNA干扰的机制

2.2.1 概述

2.2.2 起始RNA的形成

2.2.3 RNAi 效应

2.2.4 RNAi 作用的自我扩增机制

2.3 RNA干扰的特征

2.4 RNA干扰的生物学意义

2.5 RNA干扰的应用

2.5.1 高通量研究基因功能

2.5.2 研究信号传导通路

2.5.3 基因治疗

3. 基因肝靶向输送方法

3.1 体内常用基因输送方法

3.2 基因肝靶向输送

4. 研究的目的与内容

第二章靶序列的选择及siRNA 的合成与表达载体的构建

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.2.1 乙型肝炎表面抗原基因的确定

2.2.2 靶序列的选择

2.2.3 siRNA 与化学修饰siRNA 的合成

2.2.4 siRNA 表达载体构建与鉴定

3. 实验结果

3.1 乙型肝炎表面抗原基因序列的确定

3.2 靶序列的选择

3.3 siRNA 合成

3.4 siRNA 表达质粒构建

4. 分析与讨论

第三章 siRNA 及表达载体体外抑制乙肝病毒复制与表达的研究

1. 引言

2. 材料与仪器

2.1 材料

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 DOTAP 脂质体的制备

2.2.3 细胞转染

2.2.4 病毒DNA 的提取

2.2.5 RNA 提取

2.2.6 乙肝表面抗原的提取

2.2.7 定量PCR 检测乙肝病毒DNA 水平

2.2.8 Northern blot

2.2.9 乙肝表面抗原的测定

2.2.10 统计分析

3. 结果

3.1 siRNA 和siRNA 表达载体对靶m RNA 的降解

3.2 针对不同靶点siRNA 对乙肝表面抗原表达的抑制作用

3.3 不同结构siRNA 对乙肝表面抗原合成的抑制作用

3.4 siRNA 抑制乙肝病毒的复制与表达

3.5 siRNA 抑制HepG2.2.15 细胞表面抗原形成的剂量效应

3.6 siRNA 在HepG2.2.15 中抑制乙肝表面抗原形成的时间效应

4. 讨论

第四章 siRNA 及表达载体体内抑制乙肝病毒复制与表达的研究

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.2.1 肝靶向基因输送

2.2.2 电脉冲转染

2.2.3 肝组织总RNA 提取

2.2.4 Northern blot

2.2.5 血液采集与HBsAg 及HBsAb 分离

2.2.6 肝脏和肌肉组织HBsAg 分离

2.2.7 HBsAg 和HBsAb 检测

2.2.8 统计分析

3. 结果

3.1 siRNA 与siRNA 表达载体在体内降解乙肝表面抗原m RNA 并抑制表面抗原的形成

3.2 siRNA 与siRNA 表达载体抑制乙肝表面抗原形成的剂量效应

3.3 不同形态siRNA 在体内抑制乙肝表面抗原形成的时间效应

3.4 不同形态siRNA 对预先存在体内乙肝表面抗原表达质粒表达的干扰作用

3.5 siRNA 表达质粒在肌肉内抑制乙肝表面抗原质粒的表达和表面抗体的诱导形成

4. 讨论

第五章提高外源基因体内外转染效率的研究

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 含钆喷酸葡胺或碘海醇阳离子脂质体的制备

2.2.2 细胞培养和转染

2.2.3 多室脂质体的制备及体内输送

2.2.4 肝脏介入输送

2.2.5 尾静脉高压注射

2.2.6 荧光素酶活性检测

2.2.7 乙肝表面抗原检测

3. 结果

3.1 阳离子脂质体转染细胞的研究

3.1.1 DOTAP-钆喷酸葡胺脂质体提高质粒DNA 对细胞的转染

3.1.2 DOTAP-碘海醇脂质体提高质粒DNA 对细胞的转染

3.2 质粒DNA 肝靶向输送的研究

3.2.1 门静脉介入输送提高质粒在肝脏内的表达

3.2.2 阳离子脂质体和多室脂质体对质粒DNA 肝靶向输送的作用

3.2.3 尾静脉高压注射（hydrodynamic injection）提高质粒肝靶向表达

4. 讨论

第六章乙肝 DNA 疫苗电转染免疫在诱导小鼠免疫应答和抗乙肝病毒感染的作用研究

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.2.1 DNA 疫苗（乙肝表面抗原表达质粒）免疫

2.2.2 乙肝表面抗原表达质粒肝靶向输送

2.2.3 乙肝表面抗原和表面抗体的分离

2.2.4 乙肝表面抗原和表面抗体的检测

2.2.5 IFN-γ水平检测

2.2.6 肝脏表达HBsAg 的免疫组化检测

2.2.7 肝组织H&E 检测

2.2.8 丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测

2.2.9 统计分析

3. 结果

3.1 电脉冲刺激提高外源基因的表达

3.2 电转染提高DNA 质粒诱导的体液和细胞免疫应答

3.3 DNA 疫苗电转染诱导的免疫应答对乙肝病毒感染的保护作用

3.4 肝脏乙肝表面抗原表达的免疫组化分析

3.5 小鼠血液中丙氨酸氨基转移酶的变化

4. 讨论

第七章总结与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表论文情况

攻读博士学位期间发表会议论文情况

致谢

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