利用番茄表达人凝血IX因子的研究

论文摘要

血友病B(hemophilia B)是人凝血IX因子(human clotting factor IX, hFIX)缺乏所引起的一种严重凝血功能障碍性疾病。编码hFIX的基因(hFIX)位于人X染色体长臂远端,被定位于Xq27. 1区域,全长34 kb,由8个外显子和7个内含子组成,cDNA全长2802bp,编码区1383bp。该病临床表现为自发性出血,严重者可导致关节变形或残疾。血友病B严重威胁着人类健康,为X染色体隐性遗传疾病,在男性中的发病率为三万分之一。血友病不仅给患者带来身体和精神上的痛苦,也使之承受着沉重的经济负担。血友病B治疗主要采用蛋白替代疗法,即静脉注射血液或血液制剂,但因存在材料来源有限、生产成本高等缺陷,使临床应用受限。利用植物系统表达或生产临床急需的凝血IX因子,不仅对解决上述问题具有积极作用,也为凝血IX因子生产提供了一条新途径。本研究尝试利用植物系统——番茄表达凝血IX因子(hFIX)。首先,构建含hFIX minigene的番茄果实特异性表达载

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（abbreviation）
• 第一章 绪论
• 1.1 血友病B 对人类危害
• 1.2 血友病B 的治疗
• 1.2.1 蛋白替代治疗
• 1.2.2 基因治疗
• 1.3 人凝血IX 因子的研究
• 1.3.1 基因结构
• 1.3.2 生物活性
• 1.4 植物生物反应器
• 1.4.1 概念和研究进展
• 1.4.2 优点
• 1.4.3 技术研究热点
• 1.4.4 番茄作为植物生物反应器的现状和优势
• 1.5 选题依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶与试剂盒
• 2.1.4 激素、抗生素与培养基
• 2.1.5 寡核苷酸引物
• 2.1.6 其他材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 工程农杆菌的制备
• 2.2.3 番茄的遗传转化
• 2.2.4 转基因番茄PCR 检测
• 2.2.5 转基因番茄的Southern blot 分析
• 2.2.6 转基因番茄的RT-PCR 分析
• 2.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定转基因番茄中的hFIX 蛋白
• 2.2.8 凝血因子功能活性测定[69]（aPPT 法）
• 第三章 结果与分析
• 3.1 植物表达载体构建
• 3.1.1 番茄果实特异性表达载体构建
• 3.1.2 PCR 检测
• 3.1.3 测序
• 3.2 工程农杆菌的制备
• 3.3 番茄的遗传转化
• 3.3.1 卡那霉素（Kan）选择压的确定
• 3.3.2 农杆菌介导的番茄遗传转化
• 3.4 转基因番茄的PCR 检测
• 3.5 转基因番茄Southern blot 分析
• 3.6 转基因番茄的RT-PCR 分析
• 3.7 转基因番茄的ELISA 检测
• 3.7.1 番茄可溶性总蛋白浓度的测定
• 3.7.2 双抗体夹心ELISA 法检测hFIX 蛋白
• 3.8 凝血因子功能活性的测定
• 第四章 讨论
• 4.1 番茄作为生物反应器的表达宿主
• 4.2 基因沉默的现象与解决办法
• 4.2.1 基因沉默现象
• 4.2.1 基因沉默产生原因
• 4.2.3 克服基因沉默的策略
• 4.3 提高外源蛋白在植物中的表达量
• 4.4 转基因安全问题
• 4.4.1 潜在过敏原问题
• 4.4.2 抗生素抗性问题
• 4.4.3 转基因食品的潜在毒性
• 第五章 小结
• 附录 实验涉及的试剂和培养基配方
• 参考文献
• 致 谢
• 攻读学位期间发表的学术论文