论文摘要
目的本课题在前期应用基质金属蛋白酶-7（MMP-7）降低异种（猪）脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）等高免疫原成分的研究基础上,应用京尼平（Genipin）及真空冷冻干燥处理Xeno-ADM,以进一步降低其免疫原性、提高组织稳定性并增加其孔隙率。观察应用MMP-7、Genipin及真空冷冻干燥处理对网状层猪脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）组织结构及细胞相容性的影响。方法机械法取健康雄性白色家猪0.5-0.6mm厚网状层真皮54块,每块约10mm×5mm大小,按随机数字表法分为正常对照组（A1组）、脱细胞组（B组）、脱细胞+MMP-7组（C组）、脱细胞+MMP-7+Genipin组（D组）和脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥组（E组）,A1组6块,其余每组12块；另取同样大小异体脱细胞真皮基质（Allo-ADM）6块作为细胞相容性实验对照组（A2组）。采用HE染色、免疫组化染色、扫描电镜、MTT试验和ELISA法,检查网状层真皮中细胞、细胞碎片、波形蛋白（Vimentin）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）残留情况,组织结构变化和细胞毒性；接种第5代人真皮成纤维细胞（Fb）于各组网状层真皮和Allo-ADM真皮面培养,动态观察Fb生长情况及上清液中白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）的含量变化。结果（1）A1组标本中除胶原外,毛囊及毛发结构完整,含有大量细胞,Vimentin、 Col Ⅳ阳性染色明显。B组标本毛囊内毛发、上皮根鞘、细胞核、细胞碎片样结构及Vimentin、LN、ColⅣ仍有少量残留,C、D、E组被完全脱除。D、E组较B、C组韧性增加。4组胶原纤维结构完整,排列与A1组相似且胶原纤维之间间隙均有所增大,其中C、D组间隙相近且均大于B组,E组最大。（2）根据GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价》细胞毒性分级标准判定,细胞毒性试验显示B、C、D、E组细胞毒性均为0或1级。（3）Fb在各组均能生长增殖并随时间延长而增加,D、E组表面细胞密度较高而A2、C组则组织内部较明显,B组表面及组织内部细胞密度均较其他组低。各组第7天培养液上清中IL-6、IL-8含量（分别为132±14,104±9,122±14,120±12,128±17和135±18,102±17,127±18,134±23,141±24pg/ml）明显高于第3天（分别为55±13,34±8,48±8,50±13,49±12和93±19,63±11,82±15,82±6,89±16pg/ml）（F值分别为421.185和110.257,P值均小于0.01）; A2、C、D、E组之间含量无显著差异（P>0.05）,但均较B组高（P<0.01）。结论脱细胞+基质金属蛋白酶（MMP-7）+京尼平（Genipin）+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架,高抗原性成分明显降低,组织结构保持正常、间隙扩大,无细胞毒性,细胞相容性好。细胞长入组织内部较少可能与京尼平增加组织韧性有关,有待体内复杂情况下进一步研究证实。
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