糖皮质激素诱导绿色荧光蛋白（GFP）在烟草中的表达

论文摘要

糖皮质激素化学诱导表达体系以嵌合型转录因子 GVG 为基础,由酵母的 Gal4 DNA结合域,单纯疱疹病毒蛋白 16 (VP16) 的酸性活化域和哺乳动物糖皮质受体调节域( GR)融合而成。在没有诱导剂糖皮质激素存在的情况下,GVG 蛋白与其他蛋白形成蛋白复合体保留在细胞质中;加入诱导剂后,诱导剂与 GVG 蛋白结合使蛋白发生变构,与其他蛋白脱离后进入细胞核内与诱导启动子结合,启动目的基因的表达。 本实验利用农杆菌介导的方法,将携带双元诱导表达系统的载体 pIndex3 转入到野生型烟草当中,经过鉴定,初步建立了糖皮质激素诱导表达系统。 在这个系统当中,转录因子 GVG 的基因由组成性启动子 35S 控制表达,绿色荧光蛋白基因 mgfp5 作为诱导表达的目的基因在诱导启动子的控制之下。诱导启动子由 4 个串联的 GAL4 上游激活序列(UAS)和一个微小 35S 启动子组成。绿色荧光蛋白的转录受到诱导剂的严格调控。未加诱导剂地塞米松(dexamethasone, Dex,人工合成糖皮质激素)时,检测不到绿色荧光蛋白的表达,加入诱导剂后首先在 RNA 水平检测到了mgfp5 的转录,绿色荧光蛋白随着诱导剂地塞米松的扩散沿叶脉开始表达,当诱导剂去除后绿色荧光蛋白停止表达。诱导剂对基因表达的调控首先表现在新生叶上,老叶对诱导剂的敏感程度相对滞后一些。在质粒构建过程中 mgfp5 两端分别加上马铃薯 X 病毒(PVX)的非翻译区,结果表明非翻译区并未抑制绿色荧光蛋白的表达,为下一步试验奠定了基础。GVG 系统对诱导剂具有非常高的专一性,并且对基因表达的控制非常严格,几乎没有基础表达,可以从时间空间及数量上对目的基因进行精确调控,这一系统的建立为今后利用化学诱导的方法进行理论和应用研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRCT
• 目录
• 1 引言
• 1.1 化学诱导表达系统
• 1.1.1 理想的诱导表达系统应满足的要求
• 1.1.2 化学诱导表达体系的构建模式
• 1.2 激活类诱导系统
• 1.2.1 糖皮质激素诱导系统
• 1.2.2 其他激活诱导系统
• 1.3 化学诱导系统的应用
• 1.3.1 启动关闭转入基因的过表达
• 1.3.2 外源毒害基因的表达
• 1.3.3 激活复杂生命过程中低表达的内源基因
• 1.3.4 关于RNA 沉默机理与应用的研究
• 1.3.5 基因的定位表达
• 1.3.6 转录单元间转录干扰的研究
• 1.3.7 无标记转基因体系的建立
• 1.3.8 高水平扩增mRNA 系统的构建
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌种
• 2.1.3 化学试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.3 植物基因组DNA 的分离
• 2.2.4 再生植株的PCR 检测
• 2.2.5 总RNA 的分离
• 2.2.6 RT-PCR
• 2.2.7 糖皮质激素的处理
• 2.2.8 绿色荧光蛋白的诱导表达
• 3 结果
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 TA 克隆
• 3.1.2 DNA 测序及分析
• 3.1.3 植物诱导表达载体 pIndex-NTR-gfp 的构建及重组子的鉴定
• 3.2 农杆菌介导的烟草转化
• 3.3 转基因植株的 PCR 检测
• 3.4 转基因 gfp 在植物中表达的 RT-PCR 检测
• 3.5 绿色荧光蛋白在植物中诱导表达的情况:
• 4 讨 论
• 4.1 化学调控双元表达载体 pIndex3-NTR-gfp 的构建
• 4.2 糖皮质激素调控绿色荧光蛋白表达的转基因烟草的获得及鉴定
• 5 结 论
• 参考文献
• 附 录
• 致 谢