谷氨酸转运蛋白载体的构建及鉴定

论文摘要

谷氨酸转运蛋白也称兴奋性氨基酸转运蛋白（Excitatory amino acid transporter,EAAT）主要存在于神经细胞和神经胶质细胞浆膜上,EAAT转运谷氨酸是离子依赖的耗能过程。目前认为,细胞外没有使谷氨酸代谢失活的酶,而使谷氨酸在神经系统灭活的唯一途径是通过神经细胞的再摄取和吸收,其中起主要作用的是位于神经胶质细胞上的EAAT2和位于神经元上的EAAT3。本课题拟构建EAAT2和EAAT3的表达载体,为与EAAT2和EAAT3减少的相关中枢神经系统疾病提供一定的基础。实验一重组腺病毒EAAT2的构建及鉴定目的:利用基因克隆技术克隆EAAT2基因全长cDNA,并构建及鉴定其重组腺病毒载体。方法:从大鼠脑组织中用RT-PCR方法得到EAAT2的基因全长片断,将其导入T载体进行测序,得到准确的序列后再导入腺病毒穿梭质粒当中。将穿梭质粒和病毒骨架通过电穿孔导入细菌内进行重组,挑选阳性克隆,提取重组后的质粒,用脂质体法将其在体外转染入HEK293细胞,并在细胞内部包装。用倍比稀释感染法测定腺病毒的滴度。结果:成功将EAAT2连入带有绿色荧光的腺病毒载体中,病毒滴度为2×108 pfu/ml。结论:成功构建了pAd/EAAT2载体,为EAAT2缺乏的中枢神经系统疾病的治疗和研究奠定了基础。实验二大鼠EAAT3真核表达载体的构建和在Hella细胞中的表达目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3（EAAT3）的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞。方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT- PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功。免疫印迹法证实EAAT3基因的表达。结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 重组腺病毒 EAAT2 的构建及鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 大鼠 EAAT3 真核表达载体的构建和在 Hella 细胞中的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢