野油菜黄单胞菌锌吸收调控蛋白的调控机理研究

论文摘要

锌吸收调控蛋白（Zinc uptake regulator, Zur）存在于许多细菌中,它的主要作用是当细胞内的锌离子浓度过高时抑制高亲和性锌吸收系统（high affinity zinc uptake systems）的表达;在野油菜黄单胞菌8004菌株（Xanthomonascampestris pv. campestris strain 8004, Xcc 8004）中Zur由ORF XC1430编码。Xcc Zur除了参与锌离子吸收调控外,还在EPS产生和致病过程中发挥重要作用（Dong-Jie Tang, et al. 2005. MPMI.）。本工作内容之一是在大肠杆菌中超量表达并纯化了Xcc Zur蛋白,然后和受它调控的部分基因（XC0376、XC2386和XC3668）的启动子进行体外结合试验（electrophoresis mobility shift assay, EMSA）。结果显示Zur蛋白能与这3个基因的启动子进行特异性结合。对这三个启动子的序列进行分析表明这3个启动子的-35区均存在E. coli Zur-box（5’-AAGTGTGATATTAAACA TTTCATGACTA-3’）相似的序列。DNase Ⅰ足迹试验表明在XC3668的启动子区存在一个明显受Zur保护的区域。这些结果说明Xcc Zur的调控机制可能与E. coli Zur的调控机制相似。本工作还用定点突变方法对Zur蛋白中的23个高度保守氨基酸进行了突变,把这23个单点突变的zur分别克隆到pLAFR6上,并分别导入Xcc 8004 Zur的突变体NK1430中,然后检测锌离子吸收、EPS产生和致病性功能,以确定这些保守氨基酸位点与锌吸收调控、EPS产生和致病性的关系。结果显示Ala88→Thr88、Gly152→Ala152、Phe153→Tyr153共3个氨基酸位点的取代仅影响锌离子

论文目录

第一章前言

1.1 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）概况

1.1.1 黄单胞菌的形态和特征

1.1.2 黄单胞菌引起的主要病害及其致病机制

1.1.3 黄单胞菌的应用

1.2 野油菜黄单胞菌致病机理的分子遗传学研究概况

1.2.1 hrp基因簇与Hrp TTSS分泌系统装置

1.2.2 多糖

1.2.3 胞外酶

1.2.4 依赖于Ⅲ型分泌系统（TTSS）的效应物

1.3 锌吸收调控蛋白研究进展

1.3.1 原核生物锌离子代谢概述

1.3.2 锌吸收调控蛋白（Zur）简介

1.3.3 Zur调控机理研究进展

1.3.4 野油菜黄单胞菌中锌吸收调控蛋白的初步鉴定

1.4 本工作的目的与内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 本实验所用的菌株和质粒见表

2.1.2 培养基及生长

2.1.3 抗生素及其贮存、使用浓度

2.1.4 溶液与缓冲液

2.2 方法

2.2.1 Xcc 8004 Zur23个保守氨基酸位点的突变设计

2.2.2 常规PCR反应

2.2.3 重组PCR反应

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 PCR产物的回收与纯化

2.2.6 质粒的提取

2.2.7 总DNA的提取

2.2.8 限制性内切酶酶切

2.2.9 DNA连接

2.2.10 电脉冲感受态细胞的制备

2.2.11 转化

2.2.12 三亲本接合

2.2.13 胞外多糖的检测

2.2.14 植株的致病性试验

2.2.15 锌敏感性实验

2.2.16 Zur蛋白、点突变ZurM蛋白的表达纯化

2.2.17 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.2.18 DNA电泳迁移率变动试验（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）

2.2.19 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.20 Dnase Ⅰ足迹试验

第三章结果与分析

3.1 Xcc Zur蛋白能与它所调控基因的启动子特异性结合

3.1.1 Xcc XC0376、XC2386、XC3668的启动子区中存在与E.coli Zur-box相似的DNA序列

3.1.2 启动子的扩增

3.1.3 Xcc Zur表达、纯化

3.1.4 Zur与启动子的结合分析

3.1.5 DNA足迹试验确定XC3668启动子上存在Zur特异性结合保护位点

3.2 Xcc Zur在锌离子吸收调控、EPS产生和致病性上的作用在结构上是分离的

3.2.1 Xcc Zur蛋白中存在23个高度保守的氨基酸位点

3.2.2 Xcc Zur点突变体的构建

3.2.3 Xcc Zur点突变体锌敏感性试验

3.2.4 Xcc Zur点突变体致病性试验

3.2.5 Xcc Zur点突变体EPS产量检测

3.2.6 Xcc Zur在锌离子吸收调控、EPS产生和致病性上的作用在结构上是分离的

3.3 Xcc Zur第126、129号半胱氨酸是Zur与其目标启动子结合所必需的。

3.3.1 Xcc Zur表达、纯化

3.3.2 Xcc Zur第126、129号半胱氨酸是Zur与其目标启动子结合所必需

第四章结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.2.1 关于Xcc Zur的调控机制

4.2.2 关于Xcc Zur23个高度保守氨基酸突变所用的点突变方法

4.2.3 关于Xcc Zur蛋白23个高度保守氨基酸在锌离子吸收、EPS产生和致病性中的作用

4.2.4 关于Xcc Zur蛋白第126、129号半胱氨酸在该蛋白发挥调控功能中可能的作用

参考文献

致谢

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